Bowtie使用介紹
Bowtie（下載）是一個超級快速的，較為節省內存的短序列拼接至模板基因組的工具。它在拼接35鹼基長度的序列時，可以達到每小時2.5億次的拼接速度。Bowtie並不是一個簡單的拼接工具，它不同於Blast等。它適合的工作是將小序列比對至大基因組上去。它最長能讀取1024個鹼基的片段。換言之，bowtie非常適合下一代測序技術。
在使用bowtie前，需要使用bowtie-build來構建比對模板。如果你需要比對是比較常見的基因組的話，你可以去下載你所需要的Pre-built indexes文件就可以了。如你要想建立human chr1的索引，可采用下列命令：-bash-3.2$ ./bowtie-build genomes/hg19/chr1.fa chr1 ，結果會生存chr1.1.ebwt chr1.2.ebwt chr1.3.ebwt chr1.4.ebwt四個索引文件，然后把這四個文件移到程序所在文件夾的indexes文件夾中就可以了，如果你機器的內存不夠4G，建議不要做整個基因的索引，可每條染色體做一個。如果你沒有基因組序列，也可使用軟件自帶的程序(./scripts/make_hg19.sh)建立索引。
如前所述，bowtie適合於將短序列拼接至大的模板上，尤其是基因組。模板最小尺寸不能小於1024鹼基，而短序列最長而不能超過1024鹼基。 Bowtie設計思路是，1）短序列在基因組上至少有一處最適匹配， 2）大部分的短序列的質量是比較高，3）短序列在基因組上最適匹配的位置最好只有一處。這些標准基本上和RNA-seq, ChIP-seq以及其它一些正在興起的測序技術或者再測序技術的要求一致。
如果bowtie在你的機器上運行起來很慢，那么你可以試試以下的一些辦法來讓它跑得快一些：
盡可能的使用64位bowtie。很顯然，64位運算會比32位運算更快。所以最好使用支持64位運算的計算機來運行64位的bowtie。如果你是從原文件開始編譯程序，在g++編譯時，你需要傳遞-m64參數，你也可以在make的時候加入這一信息，比如說傳遞BITS=64給make，具體的：make BITS=64 bowtie。想知道你自己運算的是什么版本的bowtie，你可以運行bowtie –version
如果你的計算機有多個CPU或者CPU內核，那么請使用-p參數。-p參數會讓bowtie進入多線程模式。每一個線程都會使用單獨的CPU或者CPU內核。這種並行的運算模式也會大大加快運算速度。
如果你的報告文件中每條短序列都有太多的匹配位點（超過10）那么你可以試着重新使用bowtie-build加上 –offrate參數，如bowtie-build –offrate 4。-o/–offrate默認值為5，每下降1，比對速度會增加1倍，但是系統消耗（硬盤空間和內存）也會加倍。
如果你的系統配置太低，比如內存不足4GB，那么建議你在bowtie的時候使用–offrate參數。與上一條相反的，你需要加大 offrate的值。bowtie –offrate 6. 其默認值為5。每增加1，內存空間的要求下降，這樣會減少讀取硬盤當中虛擬內存的次數，速度反而會有所上升。
-n模式與-v模式。
默認的，bowtie采用了和Maq一樣的質量控制策略，設置 -n 2 -l 28 -e 70。總的來說，比對模式分為兩種，一種是 -n 模式， 一種是 -v 模式，而且這兩種模式是不能同時使用的。bowtie默認使用-n模式。
-n模式參數： -n N -l L -e E
其中Ｎ，Ｌ，Ｅ都為整數。-n N 代表在高保真區內錯配不能超過Ｎ個，可以是0?3，一般的設置為2。-l L代表序列高保真區的長度，最短不能少於5，對於短序列長度為32的，設置為28就很不錯。-e E代表在錯配位點Phred quality值不能超過E，默認值為40。Phred quality值的計算式為：-10 log(P,base(10))
Phred Quality值 錯配可能性 正配可能性
10 1/10 90％
20 1/100 99％
30 1/1000 99.9％
40 1/10000 99.99%
50 1/100000 99.999%
而-v模式的參數相對較少。
-v模式參數：-v V
其中V為整數。-v V代表全長錯配不能超過Ｖ個，可以是0?3。這時，不考慮是否高保真區，也不考慮Phred quality值。
–best 與–strata
–best參數代表報告文件中，每個短序列的匹配結果將按匹配質量由高到低排序。–strata參數必須與–best參數一起使用，其作用是只報告質量最高的那部分。所謂質量高低，其實就是指錯配的鹼基數，如果指定了-l L參數，那就是在高保真區內的錯配數，否則就是全序列的錯配數。如果你還指定了 -M X的話，那就會在質量最高的當中，隨機選擇X個來報告。也就是說，當我們指定了-M 1 –best –strata的話，那就只報告1個最好的。
對於輸入，-q是指輸入的文件為FASTQ(文件擴展名通常為.fq或者.fastq)格式；-f是指輸入文件為FASTA(文件擴展名通常為.fa, .mfa或者.fna)格式；-c是指在命令行直接輸入要比對的序列。
下面就是一個具體的例子：
./bowtie -v 2 -M 1 –best –strata Genomes/hg19_ebwt/hg19 Pol2ChIP.fastq Pol2ChIP.map
./bowtie -S -t -p 8 -q –chunkmbs 128 hg18_combined.fa.bowtie -1 Pair1.fastq -2 Pair2.fastq bowpeout.sam
./bowtie -S -t -p 8 -q -I 0 -X 300 –chunkmbs 128 hg18_combined.fa.bowtie -1 Pair1.fastq -2 Pair2.fastq bowpeout.sam
time bowtie -p 2 -v 2 -k 11 -m 10 -t –strata –best hg19.index -1 sample_10M_1.fastq -2 sample_10M_2.fastq sample.bowtie_aln.txt
./bowtie-p 5 -m 10 -f trx -1 mate1.fa -2 mate2.fa >output