WGS數據分析目的：檢測出每個樣本基因組中的變異集合（不同樣本中的差異序列）
WGS數據分析流程分為三步：原始數據質控 -> 數據預處理 -> 變異檢測
1.原始數據質控階段：拿到原始測序數據 -> QC過濾低質量的read數據
2.數據預處理階段：read比對 -> sort排序 -> 去除重復 -> 局部重比對 -> 鹼基質量校正（BQSR） -> 變異檢測
3.變異質控過濾（VQSR） -> 結果
分析過程中所需軟件：
BWA（Burrow-Wheeler Aligner）:最權威，使用最廣的NGS數據比對軟件（ https://github.com/lh3/bwa ）
Samtools：一個專門用於處理比對數據的工具（https://github.com/samtools/samtools）
Picard：著名組學研究中心Broad研究所開發的NGS數據處理工具，功能與Samtools部分重疊，但更多的是互補，由Java編寫（http://broadinstitute.github.io/picard/ ）
GATK：目前最權威，使用最廣的基因數據變異檢測工具。有3.x和4.x兩個版本，4.x使用了新的設計模式，做了很多功能的整合，是更適合於大規模集群和雲運算的版本，后續GATK團隊也將主要維護4.x的版本，而且它的代碼是100%開源的，3.x只有部分開源（https://software.broadinstitute.org/gatk/download/）
tabix：可以對NGS分析中常見格式的文件建立索引，從而加快訪問速度，支持VCF，BED，GFF，SAM等格式文件（VCF文件壓縮時不可用gzip替代bgzip； https://sourceforge.net/projects/samtools/files/tabix/）
fastp：一個對fastq文件進行處理的一站式工具支持多線程，有基本的過濾功能和生成質控報告功能，也可以對雙端測序數據中overlap區間不一致的鹼基進行校正，自動識別頭序列並去除，自動去除mRNA測序數據中的polyG序列以及拆分輸出等（https://github.com/OpenGene/fastp）
參數fastp \
-i test.R1.fastq.gz # read1測序文件名
-o test.R1.clean.fastq.gz # read1 輸出文件名
-I test.R2.fastq.gz # read2 測序文件名
-O test.R2.clean.fastq.gz # read2 輸出文件名
-w 4 # 線程數
-l 150 #輸出序列最短長度
-h test.status.html #質控報告
質控定義：質控的含義和目的是指通過一定的標准，最大可能地剔除假陽性的結果，並盡可能地保留最多的正確數據
認識一個原始的測序數據（fastq data）：
<1>read各個位置的鹼基質量值分布;
<2>鹼基的總體質量值分布;
<3>read各個位置上鹼基分布比例，目的是為了分析鹼基的分離程度;
<4>GC含量分布;
<5>read各位置的N含量;
<6>read是否還包含測序的接頭序列;
<7>read重復率，這個是實驗的擴增過程所引入的。
整體流程：
（1）fastp質控
fastp -i read1.fq -I read2.fq -o out_read1.fq -O out_read2.fq
gzip out_CRR125938_f1.fq #壓縮out_read文件
gzip out_CRR125938_f2.fq
（2）比對
把測序數據定位到參考基因組上，確定每個read在基因組中的位置。使用軟件BWA完成。
<1>創建索引
bwa index -a is input.fa #操作執行完畢會增加五份索引文件以input.fa為前綴,.amb;.ann;.bwt;.pac;.sa為后綴
samtools faidx input.fa #建立一個以.fai為后綴的文件，根據這個文件和源文件可以快速提取其任意區域序列
<2>比對（使用bwa完成）
bwa mem -t 4 -R '@RG\tID:foo\tPL:illumina\tSM:read' input.fa out_read1.fq.gz out_read1.fq.gz | samtools view -Sb - > read1.bam && echo "** bwa mapping done **"
#首先利用bwa men比對模塊將read質控后的測序數據定位到參考基因組 -t：指定線程 -R：指定組別標識 ； 通過管道將比對的數據引流到samtools轉換為BAM文件， 然后重定向輸出到文件保存；成功則輸出** bwa mapping done **
<3>排序
samtools sort -@ 4 -m 4G -O bam -o read.sort.bam read.bam && echo "** BAM sort done **"
#將用samtools對原始的比對結果按照參考序列位置從小到大進行排序 -@：設置排序和壓縮的線程數，默認單線程；-m：每個線程的運行內存大小； -o：排序后輸 出文件 ，只有這個步驟完成之后才可以繼續往下，成功則輸出** BAM sort done **
<4>標記pcr重復
gatk MarkDuplicates -I read.sort.bam -O read.sorted.markdup.bam -M read.sorted.markdup_metrics.txt && echo "** markdup done **"
#成功輸出** markdup done **
<5>創建比對索引文件
samtools index read.sorted.markdup.bam && echo "** index done **"
<6>變異檢測
gatk CreateSequenceDictionary -R input.fa -O input.dict && echo "** dict done **"
#.dict文件的名字前綴需要和fasta的一樣，並跟它在同一個路徑下
<7>生成中間文件gvcf
gatk HaplotypeCaller -R input.fa --emit-ref-confidence GVCF -I read.sorted.markdup.bam -O read.g.vcf && echo "** gvcf done **"
<8>通過gvcf檢測變異
gatk GenotypeGVCFs -R input.fa -V read.g.vcf -O read.vcf && echo "** vcf done **"
<9>壓縮並用tabix構建索引，方便分析
bgzip -f /home/st20171401139/WGS/CRR125938.vcf
tabix -p vcf /home/st20171401139/WGS/CRR125938.vcf.gz