人類基因組概況：
人類基因組由ATCG四種鹼基組成，但是CG的含量低於50%，所以CG含量低於AT含量。
一個基因組的dna大約3ug。
snp：
平均每100到1000個鹼基會出現1個SNPs，不過密度並不均勻。
如果按照每1000個鹼基存在1個SNP來計算，人類30億個鹼基中，大約有300萬個SNPs。
人類基因組的突變頻率10的-6次方。即：每10的6次方個鹼基，就會發生一個突變。
基因組長度：
人類基因組有30億個鹼基（3*10的10次方）。人類基因組的exon的長度大約1*10的7次方，占基因組的2%~3%。
假如平均一個protein的長度為500個amino acid（氨基酸），那么編碼一個protein需要的鹼基數為500*3=1500bp=1.5kb。那么，1個protein占exon的鹼基數：1500/（1*10的7次方）≈10的4次方，即1個protein占exon鹼基數的萬分之一。
基因類型：
Ensemble數據庫中有5萬多個基因。其中，2萬多個蛋白編碼基因，還有假基因、microRNA、LincRNA等。GeneCode的gtf文件中，有一列是genetype，它分的類型是：protein coding、LincRNA、假基因。
即：基因可分為兩大類編碼蛋白的基因（包括：protein coding gene、pseudogene、LincRNA）、不編碼蛋白的基因。
基因區域：
UTR：不翻譯成蛋白。 3`UTR：轉錄起始->翻譯起始（ATG）之間的區域。5`UTR：翻譯終止->轉錄終止之間的區域。
閱讀框：開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)從DNA序列中，從起始密碼子開始，到終止密碼子結束的一段具有編碼蛋白質功能的鹼基序列。
intergenic：DNA不轉錄成RNA的區域。落入該區域的突變，不知道功能、不關注、不找hotspot。人類基因組98%是intergenetic區域。
introgenic：DNA轉錄成RNA的區域，包括：upstream，intron，exon，downstream，non-coding RNA，lincRNA。只關注落入introgenic區域的突變。即：只關注能轉錄成RNA的區域內的突變。
基因突變：
1. 突變類型：
non-sense（無義突變）：某個鹼基突變后，導致原本編碼氨基酸的密碼子變成了終止密碼子，使肽鏈合成提前終止。
FrameShiftIndel：在閱讀框內發生的indel。突變發生的位置不是3的倍數，導致鹼基序列在翻譯成氨基酸的過程中亂套了。
missense：錯義突變。導致編碼的氨基酸發生變化。
VTR_INTRON_ncRNA：exon之外的區域發生突變。
synonymous：鹼基發生改變。但編碼的氨基酸不變，不會對形成的蛋白有影響。比如：CTA與CTG 均編碼亮氨酸，若A突變為G則該變異為同義突變。
silent：鹼基發生改變，而編碼的氨基酸也發生改變，但不影響蛋白質的編碼。
2. 突變頻率（variant allele frequency，VAF）：
假如某個snv點的VAF為0.125=12.5%，這表示：在覆蓋這個點的read數中，有12.5%的read來自B allele（即突變的那條allele），由此可以得出：25%的腫瘤細胞攜帶B allele。參照下圖。
等位基因頻率（也稱為：B allele frequency）：10萬人，9萬人攜帶的的是geneA，1萬人攜帶的是geneB。則，等位基因頻率為：1/10=10%。
3. 突變注釋的工具：
snpEff。注釋snv的工具。
4. 突變原因：
G->T：氧化損傷導致 G->A（C->T）：脫氨基導致
5. 非編碼蛋白突變的解釋：
同義突變，雖然對這個基因編碼的蛋白沒有影響。但是，會影響其他基因的表達。比如，APC有4個同義突變，這些突變會影響REEP5（它是一個tumor suppressor gene）的RNA表達值。
6.基因的拷貝數變異：
通常call CNV的工具會考慮的因素：normalization、純度、污染度、倍系。
疑問1：腫瘤病人的正常組織（如：OEC），或者正常人血液中的白細胞，對這些樣本進行靶向測序時，為什么有大量snp的突變頻率會在10%~30%之間呢？正常snp的突變頻率應該是50%或100%。
推測原因：（1）PCR擴增的偏好，也可稱為抽樣誤差。比如：該snp（A-》G，A突變為G）的突變頻率應該是50%，但是，由於擴增的偏好性，導致A allele被大量擴增，G allele擴增的少。
那么，假設攜帶正常A的allele被測了8，攜帶突變G的 allele被測了2次，則計算得到的G的allele frequency為2/10=20%。
（2）因為是靶向測序，所以有可能是此位點被不同的amplicon覆蓋。而amplicon在PCR擴增過程中會引起錯誤。
（3）基因組在此snp位置處存在拷貝數異常的現象。
（4）基因存在多拷貝的情況。比如，gene A在基因組中存在多個。
（5）純度所致。
（6）這些snp是否有組織特異性呢？在不同的組織中，存在這種狀況的snp有差異嗎？比如，某個snp在OEC中突變頻率是20%，而在WBC中是50%。存在這樣的情況嗎？
沒有驗證這種想法。
疑問2：肺癌病人的OEC與白細胞的靶向測序結果中，存在大量不一致的snp。因為所有細胞的DNA序列都是一致的，為什么會出現這樣的情況呢？
后來，我在查閱腦細胞somatic mutation時，看到一篇文獻說：其實各個組織中的基因組是不一致的。
疑問3：WGS的測序數據中，也存在很多這樣的突變頻率在10~30%之間的snv or snp。增加測序深度后，這樣的snv占的比例反而更高呢？這是為何呢？
這說明，這樣的snv是真實存在的，測序深度越高，越能檢測到更多這樣的snv。
因為是在腫瘤樣本，所以，這樣的突變可以用腫瘤組織的clone原理來解釋。即：腫瘤細胞可以被分為不同的群體，有一些群體攜帶這樣的snv，而其他的群體不存在這樣的snv。這又是為何呢？因為攜帶這些snv的細胞群體是在腫瘤形成過程的后期出現的。
但是，這個問題在測序深度很深時，應該會避免。因為大數據量時，會避免抽樣誤差。結果呢？進行上萬層的測序時，仍然存在這個問題。
重復序列：
LINE：重復序列。大腦發育過程中LINE很活躍。LINE通過反轉錄的方式，插到其它序列中。
6.7kb。轉錄成長的RNA，編碼反轉錄酶，將自己或其它序列插入到DNA中。
tanderm repeat：
repeatMaster工具，可發現基因組上的重復序列。
熟悉的基因：
abparts（BCR，B cell receptor）：B cell抗原受體。作用是識別抗原。編碼B cell抗體的基因。B cell在骨髓中淋巴細胞中重排。
一個B cell攜帶一個抗體。
一般的染色體重排只發生在一條染色體上，但是，chrom14的abparts，在兩條染色體上都發生了重排。
TCR（Tcell receptor ）：T cell抗原受體。作用是識別抗原。編碼T cell抗體的基因。分兩種TCR1和TCR2，外周血中主要是TCR2。
RB1：與細胞周期有關的一個基因。抑制磷酸化，抑制細胞增殖。
RCBTB2：在胞質中存在。與染色質濃縮有關。