Novel LncRNA的選擇
novel LncRNA選擇的原則：
1.不能選與其他基因exon重疊的lncRNA，否則，RT-qPCR結果就混合了兩個基因的表達量。
2.最好選擇基因間的lncRNA，即lincRNA，跟其他基因沒有重疊。
3.其次選擇位於其他基因intron區域的lncRNA。
4.再次，如果lncRNA的一部分與其他基因的exon重疊，另一部分不重疊，就選不重疊的那部分。
Novel LncRNA的引物設計
這里我們選取的novel LncRNA是LNC_000332,LNC_000332的fasta序列如下：
>LNC_000332:
TGGCAGCTTCAAGAACGAGTGATTTAAGAACAGCCCTCCCATCTTAGCAATGTCCCGGGGTGGCTGGAGCCACGGTCACTTCTTGGTCCTGGTCCAGAACTGTCGGTAGCGCTCCACATGCAAGTCATCACTGAGCTCCTGCTCGTACTCCTTCCTCGACTGGAGCTGAGCCTCACGCTTCCGCAGCCTGGCCCGGCGCTCCTCAGGAGACAGGGTGTCCAGATCTATGGGCATCGCCAGCATGCGCCGTGGCTCCCTGTAGCGGATGTGGATGGTGGAGCCATCCTGCTTCACCAGCAGCACGGGGTAGAGTCGTGCATAAGCCTGGCGGTGCACACGAGTGAGTGAGGCCCTGCTGCTGTCAGCTCGCCAGGAGGATGTGTGCAGGCGGCGGAGTGCAGGTCCGGTGGCCTTCACGGTGCTCTGCCTCAGCCGGCCAAGCAGGCTGCCCACGGCCGCCATTCCTCCTTACAGCCCCAGTGGCACGTGGAGGTGGTCAGTACAGGCCCTGGCGTGCAACTGCGTTGGGTGCTGCTGCGCTGCAGCCCACGACGTCACTGGCAGGCGCTGCGTCGCGCGGTATGACGTGTTCCATGGC
根據LncRNA的染色體位置相應位置的DNA序列
LNC_000332的染色體位置為:chr1:228106685-228109338,在染色體的負鏈上，我們通過UCSC來獲取相應位置的DNA序列。UCSC的官網http://genome.ucsc.edu
然后選擇Genomes,進入后點擊View,然后選擇DNA
然后在上面的position輸入基因的坐標，由於我們的坐標在DNA的負鏈,所以這里也要勾選Reverse complement,最后點擊get DNA,就得到我們想要的DNA序列，下圖為得到的DNA序列
通過AnnoLnc獲取novel LncRNA的外顯子坐標
AnnoLnc是北大生物信息中心開發出的一款分析novel LncRNA的網頁工具，網址：http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
我們輸入LNC_000332的fasta序列，然后點擊GO
信息很多，這里只截取一部分，可以看到LNC_000332包含4個外顯子區域，不過這是hg19的染色體位置，我們需要用網頁版的LiftOver來進行hg19和hg38的坐標轉換，網址：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver
可以看到4個外顯子坐標成功轉換完成，點擊View conversions就可以得到轉換完成的hg38的外顯子坐標，外顯子坐標為：
chr1:228106685-228106918
chr1:228107668-228107869
chr1:228108235-228108318
chr1:228109261-228109338
將相應位置的DNA序列與LncRNA序列比對
可以看到LNC_000332一共匹配了4段，染色體坐標分別為chr1:228106685-228106919，chr1:228107668-228107870，chr1:228108235-228108332，chr1:228109259-228109938
而外顯子的染色體坐標分別為chr1:228106685-228106918，chr1:228107668-228107869，chr1:228108235-228108318，chr1:228109261-228109338
這里可以看到LNC_000332的序列基本都在外顯子里面，所以不適合選擇這個LncRNA來做PCR驗證