10.26-qPCR引物設計

設計原則：

1.PCR擴增產物長度 :80-150bp. 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80-150bp最為合適（可以延長至300 bp）

2.引物長度一般在15-30鹼基之間。
　　引物長度（primer length）常用的是18-27bp，但不應大於38bp，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。Tm=58-60度。
　　GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3'端不能選擇A，最好選擇T。
　　引物3'端錯配時，不同鹼基引發效率存在着很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3'端最好選擇T。

5.引物自身及引物之間不應存在互補序列。
　　引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
　　兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
　　引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

設計步驟：

獲得基因序列后，打開primer 5.0

1.點擊File-new-DNA sequence 粘貼cDNA序列-as is-ok

2.點search-調整如圖參數（產物長度一般為100-300，引物長度一般為20左右，視情況調整）

3.彈出下圖窗口后，先看右邊，根據系統設計的引物進行篩選，優先評分較高的

S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再細看

• ΔG絕對值小於10
• tm在58左右，正負2度
• GC%在40%-60%
• 末端不能是A
• 不能有連續3個相同的鹼基
• 3’端一定不能有錯配

【篩選原則】：

1. 最好hairpin, dimer, false priming 沒有
2. 最好是沒有連續相同鹼基，如TTT、GGG
3. 最好兩個引物之間bp之差小於等於2，
4. 產物長度大於100，小於300最好，也可以到400
5. tm在58左右，正負2度
6.一般設計時引物18-22長度，最長不要超過25 
7.3’不能以A結尾
8.出現Found時，ΔG絕對值小於10
4.以系統給出的第一對引物為例（看框住的地方），雖然系統給出的評分比較高，但是下游引物可能出現發夾結構（Hairpin）和二聚體（Dimer）,我們可以嘗試調整一下。

彈出如下窗口后，光標點在①號位置，刪除幾個鹼基后，
點擊②號位置Analyze,點擊③號位置ok