LncRNA設計原則
LncRNA的引物設計跟mRNA的引物設計類似，都遵循以下規則：
1.引物應在核酸系列保守區內設計並具有特異性。
2.擴增產物長度在 80-150bp。最長不要超過 300bp。
3.產物不能形成二級結構(自由能小於 58.61KJ/mol)。
4.引物長度:一般在 17-25 鹼基之間,上下游引物不宜相差太大。
5.引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補,避免形成發卡結構。
LncRNA引物設計
我們通過在線工具Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)來設計引物，下圖為Primer3Plus的網頁界面：
這里我們首先需要設置General Settings,需要設置的參數:
Procuct Size Ranges:100-150bp
Primer Size:18-25bp
Primer Tm:58-60
Primer GC:45%-55%
設置完成后點擊Load Settings,然后開始輸入LncRNA的fasta序列，我們輸入一個annotated的LncRNA序列：
>ENST00000487094.1
GAGCAGGGAGGCTGCGGTGGATCAGCTGCCTGCTGTCTCTGACTGGAAGCCACTACCTTTAGGGCAGGGACTCCGACTACTTCACTCGCCACCGGATCATCTGGGTTTTGAAGAAACCAAGATGCCTTTCATTAATTCTTCCAACTAAATTAATGGAGTCACTGCATCTCGAACACCATTAGCAGAGCAGAGACAAGAGTTTTGGCTGGAAAAGGGTTCCTGCTTTTTTATCTTCTTCATTTTCTCTTGCCACCACCATGTAAGAAGTGCCTTTCACCTCCCACGATGATCCTGAGGTCTCCCCAGCCATGTGGAACTATGTGCACAATCATTATCACTGATGTACCTGTGTCTTCAGCCTGTTTGACTACACTGGGGTGAGGACGTTGTGGAACAGATGGATTATTATCTACCTGGGCTCACACAGCTAGGAGGTGATAAAGGAAAGAAGCAGCATGTAGCCATTGGACCCAACCCCTCAGCCACTGTAGAGCTTGAGAGAGCTGGATCTCTCCAAGTTATATCCAGCTTTTTAATTATCTGACAAAGGAGAACATGAAGGATGAATTCCATCATCACCAAAAAGTCATAGTGATATTAACACATGCCCTGATAACCTGAGAAAACTGCTGTGAAACCAGAGAACAGTTTGATAATGAGCCTGGGACATATACAAGAAAACCTGAGCTATAGAGTGAGTGTCTGCAAAGGCCGAGAGGGCTCCCACTATGTTCATTCTCCTGGAGGTTGCTTTTATCCAACTCACAGTTGCTTCTTTTGCTCTTTATGGAGGTGTTTGGAAATCTTGAAATTCTTAAGGTTGCTTTGACCTTCTTAGATGAAA
然后點擊綠色的Pick Primers,就能得到以下的引物序列：
這里一共出來了5對引物，我們隨便選擇一條LncRNA的引物，這里我們選擇第一條引物：
TCCCACGATGATCCTGAGGT
TGTTCCACAACGTCCTCACC
LncRNA引物特異性分析
網頁工具：NCBI Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)
1.將上下游引物復制過去
2.勾選Standard databases(nr etc.):選項
3.物種選擇human (taxid:9606)
4.勾選Somewhat similar sequence(blastn)選項
5.點擊BLAST
然后得到以下結果：
發現與AC011294.3匹配度為100%，與其他的最多為52%，而我們的LncRNA注釋為AC011294.3，所以引物設計沒有問題！