一、bwa比對軟件的使用
1、對參考基因組構建索引
bwa index -a bwtsw hg19.fa # -a 參數：is[默認] or bwtsw，即bwa構建索引的兩種算法，兩種算法都是基於BWT的（BWT search while the CIGAR string by Smith-Waterman alignment.）。-a bwtsw對於短的參考序列是不工作的，必須要大於等於10Mb；-a is 不適用於大的參考序列，必須要小於等於2G；
output：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa
2、尋找輸入reads文件的SA坐標
對於pair end數據，每個reads文件單獨做運算，single end數據就不用說了，只有一個文件。
pair end：
bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read1.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read1.fq.gz.sai
bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read2.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read2.fq.gz.sai
single end：
bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read.fq.gz.sai
主要參數說明：
-o int：允許出現的最大gap數。
-e int：每個gap允許的最大長度。
-d int：不允許在3’端出現大於多少bp的deletion。
-i int：不允許在reads兩端出現大於多少bp的indel。
-l int：Read前多少個鹼基作為seed，如果設置的seed大於read長度，將無法繼續，最好設置在25-35，與-k 2 配合使用。
-k int：在seed中的最大編輯距離，使用默認2，與-l配合使用。
-t int：要使用的線程數。
-R int：此參數只應用於pair end中，當沒有出現大於此值的最佳比對結果時，將會降低標准再次進行比對。增加這個值可以提高配對比對的准確率，但是同時會消耗更長的時間，默認是32。
-I int：表示輸入的文件格式為Illumina 1.3+數據格式。
-B int：設置標記序列。從5’端開始多少個鹼基作為標記序列，當-B為正值時，在比對之前會將每個read的標記序列剪切，並將此標記序列表示在BC SAM 標簽里，對於pair end數據，兩端的標記序列會被連接。
-b ：指定輸入格式為bam格式。bwa aln hg19.fa read.bam > read.fq.gz.sai
3、生成sam格式的比對文件
如果一條read比對到多個位置，會隨機選擇一種
single end：bwa samse hg19.fa read.fq.gz.sai read.fq.gz > read.fq.gz.sam
參數：
-n int：如果reads比對次數超過多少次，就不在XA標簽顯示。
-r str：定義頭文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步驟不進行頭文件定義，在GATK后續分析中還是需要重新增加頭文件。
pair end：bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam
參數：
-a int：最大插入片段大小。
-o int：pair end兩reads中其中之一所允許配對的最大次數，超過該次數，將被視為single end。降低這個參數，可以加快運算速度，對於少於30bp的read，建議降低-o值。
-r str：定義頭文件。同single end。
-n int：每對reads輸出到結果中的最多比對數。
4、其他
（1）
bwa mem ref.fa reads.fq > aln-se.sam 單端測序
bwa mem ref.fa read1.fq read2.fq > aln-pe.sam 雙端測序
（2）
bwa aln ref.fa short_read.fq > aln_sa.sai
bwa samse ref.fa aln_sa.sai short_read.fq > aln-se.sam
bwa sampe ref.fa aln_sa1.sai aln_sa2.sai read1.fq read2.fq > aln-pe.sam
（3）
bwa bwasw ref.fa long_read.fq > aln.sam
二、sam文件格式說明
1、
XT:A:U/R Type:Unique/Repeat/N/Mate-sw # U指第五列比對值>0;R指第五列比對值==0
參考文獻：
1、《GATK使用方法詳解（包含bwa使用）》http://www.tanboyu.com/gatk-bwa.html
2、《bwa英文操作手冊》http://www.chinadmd.com/file/ecaeoaecwzvs3trpxpwtzows_1.html