1，SAM文件格式介紹
SAM（The Sequence Alignment / Map format）格式，即序列比對文件的格式，詳細介紹文檔：http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
SAM文件由兩部分組成，頭部區和主體區，都以tab分列。
頭部區：以’@'開始，體現了比對的一些總體信息。比如比對的SAM格式版本，比對的參考序列，比對使用的軟件等。
主體區：比對結果，每一個比對結果是一行，有11個主列和一個可選列。
2，頭部區簡要介紹
@HD VN:1.0 SO:unsorted （排序類型）
頭部區第一行：VN是格式版本；SO表示比對排序的類型，有unknown（default），unsorted，queryname和coordinate幾種。samtools軟件在進行行排序后不能自動更新bam文件的SO值，而picard卻可以。
@SQ SN:contig1 LN:9401 （序列ID及長度）
參考序列名，這些參考序列決定了比對結果sort的順序，SN是參考序列名；LN是參考序列長度；每個參考序列為一行。
例如：@SQ SN:NC_000067.6 LN:195471971
@RG ID:sample01 （樣品基本信息）
Read Group。1個sample的測序結果為1個Read Group；該sample可以有多個library的測序結果，可以利用bwa mem -R 加上去這些信息。
例如：@RG ID:ZX1_ID SM:ZX1 LB:PE400 PU:Illumina PL:Miseq
ID：樣品的ID號 SM：樣品名 LB：文庫名 PU：測序以 PL：測序平台
這些信息可以在形成sam文件時加入，ID是必須要有的后面是否添加看分析要求
@PG ID:bowtie2 PN:bowtie2 VN:2.0.0-beta7 （比對所使用的軟件及版本）
例如：@PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.12-r1039 CL:bwa sampe -a 400 -f ZX1.sam -r @RG ID:ZX1_ID SM:ZX1 LB:PE400 PU:Illumina PL:Miseq …/0_Reference/Reference_Sequence.fa ZX_HQ_clean_R1.fq.sai ZX_HQ_clean_R2.fq.sai …/2_HQData/ZX_HQ_clean_R1.fq …/2_HQData/ZX_HQ_clean_R2.fq
這里的ID是bwa，PN是bwa，VN是0.7.12-r1039版本。CL可以認為是運行程序@RG是上面RG表示的內容，后面是程序內容，這里的@GR內容是可以自己在運行程序是加入的
3，主體部分介紹
主體部分有11個主列和1個可選列
QNAME 比對的序列名稱 例如：M04650:84:000000000-B837R:1:1101:22699:1759（一條測序reads的名稱）
FLAG Bwise FLAG（表明比對類型：paring，strand，mate strand等） 例如：99
RENAME 比對上的參考序列名 例如：NC_000075.6
POS 1-Based的比對上的最左邊的定位 例如：124057649
MAPQ 比對質量 例如：60
CIGAR Extended CIGAR string（操作符：MIDNSHP）比對結果信息；匹配鹼基數，可變剪接等 例如：87M
MRNM 相匹配的另外一條序列，比對上的參考序列名 例如：=
MPOS 1-Based leftmost Mate Position （相比於MRNM列來講意思和POS差不多） 例如：124057667
ISIZE 插入片段長度 例如：200
SEQ 和參考序列在同一個鏈上比對的序列（若比對結果在負義鏈上，則序列是其反向重復序列，反向互補序列） 例如：ATTACTTGGCTGCT
QUAL 比對序列的質量（ASCII-33=Phred base quality）reads鹼基質量值 例如：-8CCCGFCCCF7@E-
可選的列 以TAG：TYPE：VALUE的形式提供額外的信息
4，對於每一列內容的詳細注解
（如果某一列為“0”或“*”表示這一列沒有信息）
第一列：QNAME
進行reads比對時通常表示reads的名字，如果這條reads比對到多條序列或比對到這條序列的多個位置，相同名字會出現多次。如果是pair-end reads，相同名字會出現2次，分別表示來自於R1文件的reads和R2文件的reads，如果其matepair reads也比對2個位置，也會出現2次，則相同名字共出現4次，如果一條reads也比對2個位置，則其matepair比對1個位置，則共出現3次，如果其matepair reads沒有比對上序列也會出現1次（第三列顯示“*”），所以pair-end測序，R1文件和R2文件同時mapping，相同reads的id最少出現2次。
第二列：FLAG
數值結果如下：
1（1）該read是成對的paired reads中的一個
2（10）paired reads中每個都正確比對到參考序列上
4（100）該read沒比對到參考序列上
8（1000）與該read成對的matepair read沒有比對到參考序列上
16（10000）該read其反向互補序列能夠比對到參考序列
32（100000）與該read成對的matepair read其反向互補序列能夠比對到參考序列
64（1000000）在paired reads中，該read是與參考序列比對的第一條
128（10000000）在paired reads中，該read是與參考序列比對的第二條
256（100000000）該read是次優的比對結果
512（1000000000）該read沒有通過質量控制
1024（10000000000）由於PCR或測序錯誤產生的重復reads
2048（100000000000）補充匹配的read
具體的flag值的解釋，可以參考samtools軟件提供的結果
samtools（Version: 1.3.1）
其中的samtools flags用法可提供flag值的查找結果
About: Convert between textual and numeric flag representation
Usage: samtools flags INT|STR[,...]
例如：
samtools flags 10
0xa 10 PROPER_PAIR,MUNMAP（10=2+8）
samtools flags 12
0xc 12 UNMAP,MUNMAP（12=4+8）
具體的flag值的解釋，也可參考如下網站：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
或者在必應當中搜索flag sam點擊Explain SAM Flags-GitHub Pages進入該網頁，也可以輸入組合flag數值會出現所存在的意思
第三列：RNAME
表示read比對的那條序列的序列名稱（名稱與頭部的@SQ相對應），如果這列是“*”，可以認為這條read沒有比對上的序列，則這一行的第四，五，八，九 列是“0”，第六，七列與該列是相同的表示方法
第四列：POS
表示read比對到RNAME這條序列的最左邊的位置，如果該read能夠完全比對到這條序列（CIGAR string為M）則這個位置是read的第一個鹼基比對的位置，如果該read的反向互補序列比對到這條序列，則這個位置是read的反向互補序列的第一個鹼基比對的位置，所以無論該read是正向比對到該序列，或是其反向互補序列比對到該序列，比對結果均是最左端的比對位置
第五列：MAPQ
表示為mapping的質量值，mapping Quality, It equals -10log10Pr{mapping position is wrong}, rounded to the nearest integer, A value 255 indicates that the mapping quality is not available. 該值的計算方法是mapping的錯誤率的-10log10值，之后四舍五入得到的整數，如果值為255表示mapping值是不可用的，如果是unmapped read則MAPQ為0，一般在使用bwa mem或bwa aln（bwa 0.7.12-r1039版本）生成的sam文件，第五列為60表示mapping率最高，一般結果是這一列的數值是從0到60，且0和60這兩個數字出現次數最多
第六列：CIGAR
CIGAR string，可以理解為reads mapping到第三列序列的mapping狀態，
對於mapping狀態可分為以下幾類：
M：alignment match (can be a sequence match or mismatch)
表示read可mapping到第三列的序列上，則read的鹼基序列與第三列的序列鹼基相同，表示正常的mapping結果，M表示完全匹配，但是無論reads與序列的正確匹配或是錯誤匹配該位置都顯示為M
I：insertion to the reference
表示read的鹼基序列相對於第三列的RNAME序列，有鹼基的插入
D：deletion from the reference
表示read的鹼基序列相對於第三列的RNAME序列，有鹼基的刪除
N：skipped region from the reference
表示可變剪接位置
P：padding (silent deletion from padded reference)
S：soft clipping (clipped sequences present in SEQ)
H：hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ)
clipped均表示一條read的序列被分開，之所以被分開，是因為read的一部分序列能匹配到第三列的RNAME序列上，而被分開的那部分不能匹配到RNAME序列上。
"="表示正確匹配到序列上
"X"表示錯誤匹配到序列上
而H只出現在一條read的前端或末端，但不會出現在中間，S一般會和H成對出現，當有H出現時，一定會有一個與之對應的S出現
例如：
162M89S
162H89M
149M102S
149H102M
40S211M
20M1D20M211H
S可以單獨出現，而H必須有與之對應的S出現時才可能出現，不可在相同第一列的情況下單獨出現
N：如果是mRNA-to-genome，N出現的位置代表內含子，其它比對形式出現N時則沒有具體解釋
M/I/S/=/X：這些數值的加和等於第10列SEQ的長度
第七列：MRNM
這條reads第二次比對的位置，在利用bwa mem產生sam文件時，如果該列是“”而
第3列RNAME不是“”則表示該reads比對到第3列顯示序列名的序列上，而沒有比對到其他位置，在利用bwa aln及bwa sampe比對生成的sam文件，如果和上述情況相同，則第7列為“=”，上述情況均表示該reads只比對到這一個位置
如果第3列RNAME和第7列MRNM都為“*”，則說明這條reads沒有匹配上的序列，如果這條reads匹配兩個序列，則第一個序列的名稱出現在第3列，而第二個序列的名稱出現在第7列
第八列：MPOS
該列表示與該reads對應的mate pair reads的比對位置，如果這對pair-end reads比對到同一條reference序列上，在sam文件中reads的id出現2次，Read1比對的第4列等於Read2比對的第8列。同樣Read1比對的第8列等於Read2比對的第4列。例如：
第1列（Read id）····第4列（Read1比對位置）····第8列（mate-pair reads比對位置）
22699:1759····124057649····124057667
22699:1759····124057667····124057649
相同的reads id一個來自Read1文件，一個來自Read2文件，第4列和第8列是對應的
第九列：ISIZE
TLEN：signed observed Template LENgth （可以理解為文庫插入片段長度）
如果R1端的read和R2端的read能夠mapping到同一條Reference序列上（即第三列RNAME相同），則該列的值表示第8列減去第4列加上第6列的值，R1端和R2端相同id的reads其第九列值相同，但該值為一正一負，R1文件的reads和R2文件的reads，相同id的reads要相對來看。在進行該第列值的計算時，如果取第6列的數值，一定要取出現M的值，S或H的值不能取。
the unisgned observed template length equals the number of base from the leftmost mapped base to the rightmost mappedbase. Theleftmost segment has a plus sign and the rightmost has a minus sign
處理bam文件的主要生信軟件有
bwa，bowtie2，samtools，bedtools等
可以看mapping等多方面結果和統計，bedtools工具中genomeCoverageBed的功能是：Compute the coverage of a feature file among a genome