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The SAM Format Specification(sam格式說明)
1 The SAM Format Specification
sam是一種序列比對后的輸出格式，以tab作為分隔符，包括頭部信息和比對信息。其中頭部信息必須在比對信息之前。頭部信息的開頭是@，但是比對行不是。每一個比對行有11個重要的比對信息元素，如果比對位置和校准信息等。
1.1 An example
FCC0YG3ACXX:2:1103:1572:139769#GCTTAATG 99 chr10 60001 0 90M = 60390 479 GAATTCCTTGAGGCCTAAATGCATCGGGGTGCTCTGGTTTTGTTGTTGTTATTTCTGAATGACATTTACTTTGGTGCTCTTTATTTTGCG CCCFFFFFHHHHHJJJJJJJJIJJJJJJJ?HHGIJJJBFHIJIJIDHIHIEHJJIJJIJJJHHGHHHFFFFFFEDCEEECCDDDDEECDD XT:A:R NM:i:0 SM:i:0 AM:i:0 X0:i:2 X1:i:0 XM:i:0 XO:i:0 XG:i:0 MD:Z:90 XA:Z:chr18,+14415,90M,0; RG:Z:120618_I245_FCC0YG3ACXX_L2_SZAXPI010030-30
1.2 Terminologies and Concepts
1-based coordinate system
- 從1開始數， SAM, GFF and Wiggle 用的是這個。
0-based coordinate system
- 從0開始數， BAM, BED, and PSL用的是這個。
Phred scale
- 給一個概率0 < p <= 1 , 值是一個 −10log10p，要做一個四舍五入
1.3 The header section
每個標題行以字符“@”開頭，后面是兩個字母的記錄類型代碼。在標題中，每一行都是由制表符分隔的，除了@CO行，每個數據字段都遵循格式“TAG:VALUE”，其中TAG是一個兩個字母的字符串，定義了內容和值的格式。每個標題行應該匹配:/ ^ @[A-Za-z][A-Za-z](\ t[A-Za-z][A-Za-z0-9]:[- ~]+)+ $ /或/ ^ @CO \ t。* /。包含小寫字母的標記保留給最終用戶。
下表給出了定義的記錄類型和標記。當記錄類型出現時，需要帶有“*”的標記。
| Tag | Description |
|---|---|
| @HD | 首行，輸出文件的第一行 |
| VN* | 格式版本，接受的格式：/^[0-9]+.[0-9]+$/ |
| SO | 比對排序，有unknown (default), unsorted, queryname and coordinate,對於coordinate，排序的主鍵是RNAME，其順序由標題中的@SQ行順序定義，次要排序鍵是POS字段。對於RNAME和POS相等的對齊，順序是任意的。在RNAME字段中，所有帶有“*”的對齊都跟隨帶有其他值的對齊，但是其他的對齊順序是任意的。 |
| Tag | Description |
|---|---|
| @SQ | 參考序列字典，@SQ行的順序定義了對齊排序順序。 |
| SN* | 參考序列名字(染色體)。每一個@SQ行必須含有一個去重的SN標簽。這個字段的值是用於RNAME和PNEXT比對的記錄。正則表達式[!-)+-<>-][!-]* |
| LN* | 參考序列長度，范圍:[1,2,29 -1] |
| AS | 基因組裝配標識符。 |
| M5 | MD5用大寫字母校驗序列，並去掉gap和空格 |
| SP | 物種 |
| UR | 序列的URI。這個值應該從一個標准的協議開始，e.ghttp:或ftp:，如果不是1️⃣這些協議作為開始，那么就應該是文件系統路徑 |
| Tag | Description |
|---|---|
| @RG | read組，允許有多個無序的@行 |
| ID* | read組標識符。每一個@RG行必須含有一個去重的ID。ID這個值會被用來作為比對報告的RG標簽 |
| CN | 測序中心提供的read名稱 |
| DS | 描述 |
| DT | 測序的日期 (ISO8601 date or date/time) |
| FO | 流的順序。核苷酸鹼基陣列，與每次讀取的每個流所使用的核苷酸相對應。多鹼基流以IUPAC格式編碼，非核苷酸流以各種其他字符編碼。格式:/ \ * | ACMGRSVTWYHKDBN + / |
| KS | 與每次reads的鍵序列所對應的核苷酸鹼基數組 |
| LB | 文庫 |
| PG | 產生read組的程序 |
| PI | 預測的中值插入大小 |
| PL | 用於產生reads的平台/技術。Valid values: CAPILLARY, LS454, ILLUMINA, SOLID, HELICOS, IONTORRENT and PACBIO |
| PU | 平台單元（ Illumina or slide for SOLiD的flowcell-barcode.lane）。惟一標識符。 |
| SM | 樣本，用被測序的池命名 |
| Tag | Description |
|---|---|
| @PG | 程序 |
| ID* | 程序記錄標識符。每個@PG線必須有一個唯一的ID, ID的值用於其他@PG線程的比對PG標簽和PP標簽。在合並SAM文件以處理沖突時，可以修改PG id。 |
| PN | 程序名字 |
| CL | 命令行 |
| PP | 以前的@PG-ID。必須匹配另一個@PG標題的ID標簽。可以使用PP標記鏈接@PG記錄，鏈中的最后一條記錄沒有PP標記。該鏈定義應用於對齊的程序的順序。在合並SAM文件以處理PG id沖突時，可以修改PP值。鏈中的第一個PG記錄(即SAM記錄中的PG標記所引用的記錄)描述了在SAM記錄上操作的最新程序。鏈中的下一個PG記錄描述了在SAM記錄上操作的下一個最新程序。SAM記錄上的PG ID不需要引用鏈中最新的PG記錄。它可以引用鏈中的任何PG記錄，這意味着SAM記錄已經被PG記錄中的程序操作過，並且程序通過PP標記引用。 |
| VN | 程序版本 |
| @CO | 單行的text描述，是一個任意的說明信息。允許多個@CO行無序排列 |
1.4 The alignment section: mandatory fields(必填)
每一個比對行有11個必填選項。這些字段都是以相同順序出現，而且必須出現，但是這些值可以為0或*（取決於字段）如果無法獲得相應的信息。下表概述了SAM格式的強制字段：
| Col | Field | Type | Regexp/Range | Brief description |
|---|---|---|---|---|
| 1 | QNAME | String | [!-?A-~]{1,255} | 查詢模板名稱 |
| 2 | FLAG | Int | [0,2^16 -1] | 位標記，template mapping情況的數字表示，每一個數字代表一種比對情況，這里的值是符合情況的數字相加總和 |
| 3 | RNAME | String | *|[!-()+-<>-][!-]* | 參考序列名稱 |
| 4 | POS | Int | [0,2^29 -1] | 基於1的最左比對位置 |
| 5 | MAPQ | Int | [0,2^8 -1] | MAPping質量 |
| 6 | CIGAR | String | *|([0-9]+[MIDNSHPX=])+ | CIGAR字符串 |
| 7 | RNEXT | String | *|=|[!-()+-<>-][!-]* | 比對到的參考（染色體）名字 |
| 8 | PNEXT | Int | [0,2^29 -1] | 配對到的第一個鹼基的位置 |
| 9 | TLEN | Int | [-2 29 +1,2 29 -1] | 可以理解為文庫插入片段長度 |
| 10 | SEQ | String | *|[A-Za-z=.]+ | 序列片段 |
| 11 | QUAL | String | [!-~]+ | phred -scale基本質量+33的ASCII碼 |
1.QNAME：查詢模板名稱。具有相同QNAME的read/片段被認為來自相同的模板。QNAME ' * '表示信息不可用。
2.FLAG 位標記，下表是每一個代號代表的意義：
| Bit | Description |
|---|---|
| 1 | read是pair中的一條（read表示本條read，mate表示pair中的另一條read） |
| 2 | pair一正一負完美的比對上 |
| 4 | 片段未比對上 |
| 8 | mate沒有比對上 |
| 16 | 這條read反向比對 |
| 32 | mate反向比對 |
| 64 | 這條read是read1 |
| 128 | 這條read是read2 |
| 256 | 第二次比對 |
| 512 | 沒有通過質量控制 |
| 1024 | read是PCR或光學副本產生 |
| 2048 | 輔助比對結果 |
- 0x4是唯一可靠的告訴我們片段未比對上，如果0x4出現了，RNAME, POS, CIGAR, MAPQ, 0x2, 0x10 和 0x100 和 0x20都是沒有的
- 如果0x40和0x80都存在，片段就是線性模板的一部分，但是既不是第一部分也不是最后一個部分，如果0x40和0x80都不存在，模板中片段的索引是未知的。這可能發生在非線性模板中，或者索引在數據處理中丟失。
- 0x100 意味着片段在某些分析中是不會被用到的。
- 如果0x1不存在，0x2, 0x8, 0x20, 0x40 and 0x80也沒啥意義
3.RNAME：比對的參考序列名稱，如果@SQ頭部行存在，RNAME(如果不是“*”)必須出現在一個 SQ-SN標記中。沒比對上此處就是“*”。然而，一個未必對的片段也有一個坐標以便排序。如果RNAME 是“*”，也就沒有 POS 和 CIGAR。
4.POS：於1的第一個匹配基的最左映射位置。參考序列中的第一個基的坐標是1。對於沒有坐標的未映射讀取，POS設置為0。如果POS為0，RNAME和CIGAR也就沒有意義。
5.MAPQ：mapping質量，等於−10log 10Pr(映射位置是錯的)，四舍五入到最近的整數，值255表示映射質量特別差。
6.CIGAR：CIGAR字符串。下表為CIGAR字符串的解釋（‘*’表示無值）
| Op | BAM | Description |
|---|---|---|
| M | 0 | 比對匹配(可以是序列匹配或不匹配) |
| I | 1 | 插入到參考 |
| D | 2 | 從參考刪除 |
| N | 3 | 參考的跳過的區域 |
| S | 4 | 軟剪切(被剪切的序列存在於序列中) |
| H | 5 | 硬剪切(被剪切的序列不存在於序列中) |
| P | 6 | 填充(從填充引用中無聲刪除) |
| = | 7 | 序列匹配 |
| X | 8 | 序列不匹配 |
- H 值出現在最初或者最后操作中
- S 可證在他們和CIRAG末尾字符串中只有H操作
- 對於mRNA到基因組的比對，一個N操作符代表內含子。對於其他類型的比對，沒有定義N的解釋。
- M/I/S/=/X操作的長度之和等於SEQ的長度。
7.RNEXT:：mate的reference sequence name，實際上就是mate比對到的染色體號，若是沒有mate，則是*
8.PNEXT：如果沒有這個信息（沒比對上）就是0
9.TLEN：如果R1端的read和R2端的read能夠mapping到同一條Reference序列上（即第三列RNAME相同），則該列的值表示第8列減去第4列加上第6列的值，R1端和R2端相同id的reads其第九列值相同，但該值為一正一負，R1文件的reads和R2文件的reads，相同id的reads要相對來看。在進行該第列值的計算時，如果取第6列的數值，一定要取出現M的值，S或H的值不能取。
10.SEQ：reads片段。如果序列不存在，就是*。如果不是*，這個序列的長度等於CIGAR中 M/I/S/=/X的總和。=表示他的基礎字段（如開始為1），和參考序列的基礎字段相同。
11.QUAL：鹼基質量加33的ASCII碼（與Sanger FASTQ格式中的質量字符串相同）。一個鹼基質量是基於錯誤率的phred-scaled等於−10log 10Pr(鹼基是錯的)。這個字段可以是“*”。如果它不是*，那么seq也不是“*”，它的長度與SEQ的長度得一致。
1.5 The alignment section: optional fields
這里所有的字段都是依照TAG:TYPE:VALUE的格式， TAG的標記是兩個字符，匹配為/[A-Za-z][A-Za-z0-9]/。在一個比對行每個TAG只可以出現一次。一個TAG含有返回給客戶的小寫字母。
| Type | Regexp matching VALUE | Description |
|---|---|---|
| A | [!-~] | 可印刷字符 |
| i | [-+]?[0-9]+ | 32位整數 |
| f | [-+]?[0-9]*\.?[0-9]+([eE][-+]?[0-9]+)? | 單精度浮點數 |
| Z | [ !-~]+ | 可打印字符串，包括空格 |
| H | [0-9A-F]+ | 十六進制格式的字節數組 |
| B | cCsSiIf+ | 整數或數字數組 |
對於整數或數字數組(類型' B ')，第一個字母表示以下逗號分隔數組中的數字類型。TYPE表示TAG對應值的類型，可以是字符串、整數、字節、數組等。
下表顯示了預定義的標記。你可以自由添加新標簽，如果你的新標簽很有趣，可以給samtools發郵件。請注意，以“X”、“Y”和“Z”開頭的標記或任何位置包含小寫字母的標記都保留給本地使用，在本規范的任何未來版本中都不會正式定義。
| 字符 | 含義 |
|---|---|
| AS:i | 匹配的得分 |
| XS:i | 第二好的匹配的得分 |
| YS:i | mate 序列匹配的得分 |
| XN:i | 在參考序列上模糊鹼基的個數 |
| XM:i | 錯配的個數 |
| XO:i | gap open的個數，針對於比對中的插入和缺失 |
| XG:i | gap 延伸的個數，針對於比對中的插入和缺失 |
| NM:i | 編輯距離。但是不包含頭尾被剪切的序列。一般來說等於序列中error base的個數 |
| YF:i | 該reads被過濾掉的原因。可能為LN(錯配數太多，待查證)、NS(read中包含N或者．)、SC(match bonus低於設定的閾值)、QC(failing quality control，待證) |
| YT:Z | 值為UU表示不是pair中一部分(單末端？)、CP(是pair且可以完美匹配)、DP(是pair但不能很好的匹配)、UP(是pair但是無法比對到參考序列上) |
| MD:Z | 比對上的錯配鹼基的字符串表示 |