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概述：
基因表達模式的變化可能是由於在DNA序列不變的情況下基因組發生的修飾而引起的;
這些修飾包括胞嘧啶甲基化生成5-甲基胞嘧啶(5mC)，從而產生可遺傳的表觀突變和新的表觀等位基因。這種類型的非序列變異稱為表觀遺傳學。哺乳動物中負責產生這種DNA修飾的酶被命名為DNA甲基轉移酶(DNMT)，包括DNMTI、DNMT2和DNMT3。這些修飾可經TET蛋白催化進一步氧化，TET包含2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶家族催化結構域。在胚胎干細胞、腫瘤細胞和腦組織在內的各種哺乳動物細胞/組織中，已經證實這些蛋白能夠誘導5-甲基胞嘧啶逐步氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。從初始甲基化到DNA去甲基化過程的每個階段都可能是調控基因表達的特異性表觀遺傳標記。該篇綜述了不同植物中關於DNA甲基化氧化產物，特別是DNA羥甲基化5hmC的修飾情況，雖然目前存在爭議。一些文獻認為植物中沒有DNA去甲基化酶；另一些文獻結果認為，DNA甲基化氧化產物是主動去甲基化過程形成的，並認為植物中可能存在TET類似的蛋白，促使氧化產物的形成，以調控基因表達。在這里還總結了在植物中轉基因表達人TET保守催化區域的研究結果。
1、簡介
甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)是大多數真核生物中常見的表觀遺傳標記，參與了許多已被廣泛證實的生物學過程。它被認為是哺乳動物和其他基因組DNA中的第5鹼基。大量文獻已經闡述了DNA甲基化在轉錄和轉錄后基因沉默以及染色質重塑中的核心作用。這表明，通過siRNA在細胞核中的潛在作用，甲基化的方向與異染色質形成有關。細胞核siRNA介導的甲基化與異染色質的形成有關。這一過程涉及siRNA介導互補RNA scaffold的形成，以招募調控組蛋白尾部共價修飾的蛋白和DNA甲基轉移酶。隨后，siRNA沉默轉錄並介導染色質結構的修飾。此外，與之前的研究一致，在異染色質和siRNA簇中發現的顯著的DNA甲基化修飾對轉座子沉默也發揮關鍵作用。最近的另一項研究解釋了DNA甲基化對內源性基因表達的直接調控作用。
大量研究表明，植物基因組一系列表觀遺傳修飾參與植物生長和發育的調控，以及在植物和動物普遍存在的重要調控——基因組印記。DNA和組蛋白甲基化，尤其是4、9和27位賴氨酸甲基化修飾與DNA和組蛋白的其它修飾相比，如乙酰化、磷酸化和泛素化修飾等，是植物表觀遺傳標記更重要的修飾方式。此外，在高等植物的基因組中，5mC非常普遍存在，發揮着包括基因表達調控在內的多個作用，對於轉座元件的轉座和激活承擔重要調控作用，高頻率的表觀遺傳修飾可以顯著減少轉座元件的轉座。5-mC在植物發育過程中也起到調控基因表達的重要作用。
胞嘧啶甲基化主要發生在CG二核苷酸位點，盡管CHG和CHH位點在植物中也可顯著甲基化。該表觀遺傳的水平及其鹼基位置在植物和動物之間存在顯著差異。例如，盡管人類基因組中總胞嘧啶的甲基化總體水平相對較低（約4%），但大多數(60-80%)的CG二核苷酸都發生了甲基化。甲基化修飾頻率和模式因細胞類型不同而存在顯著差異，在不同疾病中也存在差異。與哺乳動物基因組整體甲基化修飾頻率較低不同，在植物中，基因組中的胞嘧啶甲基化水平較高，約為5-25%。例如擬南芥，CG、CHG和CHH位點發生甲基化的概率分別為22.3%、5.92%和1.51%。
下文主要評估植物基因組中是否存在5mC氧化衍生物相關的證據，並考證植物中是否含有與動物類似的TET蛋白酶等假說。
2、5mC去甲基化酶（erasers）
表觀遺傳修飾包括表觀基因組的DNA甲基化，可以通過DNA甲基化酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和識別蛋白的不同活性來維持和翻譯。總的來說，這些蛋白在動物和植物中均負責識別和解讀這些表觀遺傳信息。
盡管5mC甲基化參與調控轉錄和生長發育，但植物和動物中的5mC甲基化可被被動地清除，例如如果復制鏈沒有及時發生甲基化修飾，復制鏈DNA的甲基化在隨后的着絲粒分離而消除；也可能通過相應酶的作用而主動去甲基化。這種主動去甲基化建立在至少三種假設途徑上，(i)直接從胞嘧啶環上去除甲基基團，(ii)甲基化胞嘧啶的自我切除，(iii)5mC殘基的化學修飾和重構。哺乳動物和其他高級多細胞動物的去甲基化可以通過酶的功能完成，如TET家族酶。這些酶逐步將5mC氧化為5羥甲基胞嘧啶(5hmC)、甲酰胞嘧啶(5fC)和羧基胞嘧啶(5caC)。DNA動態去甲基化相關主題文獻資料也有類似報道，它闡述了5fC和/或5caC是DNA甲基化5mC通過TET連續氧化的產物，並可隨之通過鹼基切除修復(BER)途徑去除（圖1和圖2）。這一過程最初涉及DNA乙二醇酶，校正因甲基化、氧化或脫氨基作用導致的小的鹼基損傷。該酶移除受損的鹼基，留下一個脫鹼基位點，隨后或通過短程修復或長程修復進行修飾。
圖1：胞嘧啶衍生物甲基化和氧化甲基化循環假設。
圖2. 布氏錐蟲、人和小鼠Tet蛋白示意圖。
從功能上看，所有TET家族成員均具有激活基因轉錄活性的調控作用。例如，在胚胎干細胞(ESC)分化過程中，TET蛋白和5hmC被強烈的調控。有一種假說認為，在ESC細胞中，5hmC是在特定生理條件下TET酶形成的，並且獲得很強的證據支持。此外，研究人員還發現，三種不同的TET蛋白在小鼠中表現出不同的表達模式，但與所有哺乳動物一樣，這三種蛋白具有共同的結構特征。這些特征包括一個富含半胱氨酸的區域，一個C-末端催化結構域，包括一個雙鏈β-螺旋(DSBH)或具有HXDXnH基序的桶裝cupin fold折疊（圖3）。
研究還表明，TET1通過與Nanog基因的啟動子相互作用，形成啟動子超甲基化平衡，在胚胎干細胞中維持干細胞狀態中發揮作用。TET1和TET3都有一個被確定為CpG結合基序的CXXC DNA結合域，並可能促使TET成員向DNA的聚集。近期研究發現，通過突變人TET2的一個保守區域位點Thr1372殘基能夠使該蛋白以氧化5mC為5hmC為主，幾乎不形成5fC或5caC，從而顯著改變了底物的偏好性。
圖3.擬南芥DME糖基化酶結構域的生化表征。
3、DNA甲基化模式變化的遺傳效應
5hmC的重要性和TET基因在哺乳動物和其他后生動物中普遍存在已得到廣泛研究。連同5mC修飾，5hmC修飾在許多特定的基因組功能上發揮顯著的作用，例如哺乳動物和其他物種受精卵的發育。例如，在啟動子以及基因內區域（gene body）中5hmC發生高水平修飾。其他相關研究觀察到5hmC更易發生在基因體上。且與內含子相比，5hmC修飾鹼基在外顯子中更為豐富。綜上所述，5hmC被認為是調控基因表達的重要因素，5hmC的存在與基因表達上調高度相關。此外，該生物標志物在發育和神經元活動中的功能作用也得到了闡明。在小鼠小腦浦肯野神經元中，5hmC的豐度接近5mC的40%，而脾臟和胸腺5hmC修飾的水平較低(5-15%)。同時也發現5hmC豐度與細胞增殖呈負相關。2010年和2011年先后發表兩篇文獻首次揭示DNA羥甲基化修飾功能重要性以及其在胚胎形成中對於維持多能性的關系。一項關於小鼠受精卵父系基因組DNA去甲基化的胚胎發生研究表明，受精后基因組印記基因和失活X染色體去甲基化的激活，伴隨DNA甲基化的活躍動態變化和重塑。此外，神經回路活性與DNA修飾的關系顯示DNA去甲基化在調節成人大腦神經發生中的積極作用。一項關於人乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的發生與5hmC水平和TET基因表達水平的關聯分析的研究發現，5hmC與腫瘤的發生存在廣泛而緊密的聯系。Tet基因家族表達降低可顯著降低5hmC的修飾水平。綜上所述，所有這些證據以及其他研究均顯示了5hmC在胚胎形成和哺乳動物組織發育中的重要作用。然而，在植物中是否存在主動酶反應去甲基化過程、什么酶可能參與、DNA羥甲基化修飾在全基因組分布如何，以及5hmC表觀修飾在植物中的功能作用等都尚不清楚。
在植物中，研究人員對於DNA甲基化5mC基因組分布、DNA甲基化對基因表達的影響、以及DNA甲基化在物種形態特征和脅迫環境適應性等方面的生物學功能研究，已有大量的研究報道。例如，蒺藜苜蓿DNA甲基化研究顯示，在鹽度脅迫下，植物跨基因結構重塑DNA甲基化5mC分布特征的能力。基因區域間以及5mC序列特征的不同，甲基化重塑特征不同，其中CG的甲基化使蒺藜苜蓿在耐鹽機制方面，使特定的一些基因表達獲得一些不確切的影響。另有研究表明，當棕櫚根暴露於鹽度條件下時，啟動子DNA發生CG甲基化與基因表達呈負相關，而CNG/CNN發生甲基化與基因表達呈正相關。
至於植物去甲基化的相應現象，擬南芥存在一個螺旋-發夾-螺旋-甘氨酸/脯氨酸/天冬氨酸（HhH-GPD）DNA糖基化酶的亞家族，包括DME、ROS1、DML2和DML3，它們參與胞嘧啶主動去甲基化過程（圖4）。
研究發現，DME因涉及DNA去甲基化而對種子發育過程必不可少。受精前雌性配子DNA甲基化的主動性轉化調控必須在DME下完成。兩項不同研究認為，在植物發育過程中，其它DNA甲基化5mC糖基化酶DML2、DML3和ROS1具有維持DNA甲基化的積累，保護基因免受潛在有害甲基化。
圖4. 植物酶促DNA去甲基化途徑假說
與后生動物相比，植物中存在5hmC相關的證據有限，這引發了鑒定5hmC以及TET類似酶功能相似物是否存在的爭議。
4、 TET酶存在於植物中嗎
TET酶是氧戊二酸/鐵依賴性雙加氧2-OG 酶成員，功能最多樣化的非血紅素酶超家族之一。該酶家族在原核和真核生物中普遍存在，參與多種的重要生物活動，包括植物產物和抗生素的生物合成、翻譯后修飾、DNA/RNA損傷修復和脂質代謝。
例如，在植物中，這些酶的一個亞類包括花青素合成酶、黃烷酮3β-羥化酶和黃酮醇合成酶。這些特定的酶負責黃酮和次級產物的生物合成，他們在種子植物中廣泛存在並發揮多種生理作用，包括對生物和非生物脅迫的適應。在這個過程中，黃酮類化合物通過調節植物的生育能力和調節植物重要激素，生長素，的轉運來幫助植物應對外來脅迫。另一植物激素赤霉酸(GAs)的合成參與2(OG)-雙加氧酶這類酶的活性，它們包含GA 20-氧化酶(GA 20ox)和GA 3-氧化酶(GA 3ox)。擬南芥突變體AtGA20ox1基因表達缺失使其節間長度變短，因此影響莖高。而在水稻(Oryza sativa)和大麥(Hordeum vulgale)的類似性狀中，含有突變(如:半矮稈sd1)谷物GA20ox2已被育種家用於抗倒性，從而提高產量。
據報道，擬南芥基因組中存在130多個雙加氧酶基因。這個雙加氧酶超級家族包括一類存在於哺乳動物和植物，名為脯氨酰4-羥化酶（P4H）的重要催化酶。在哺乳動物中，這類酶已被充分研究，並根據其定位分為兩種類型，包括位於內質網的膠原型P4H和位於細胞質的低氧誘導因子(HIF)-P4Hs。這些酶參與調控哺乳動物的表觀遺傳過程、代謝反應和可能的治療應用。類似地，在植物中也存在大量編碼這類酶的同源基因。例如，擬南芥中13個推定的P4H基因，編號從ATP4H1到ATP4H13。底物的多樣性和大量功能未知的相關酶為植物負責主動調控DNA去甲基化的表觀遺傳進程提供了可能的植物2(OG)-雙加氧酶（TET類似酶）。當然，該類酶僅是復合體的一部分，該復合體還要具備與TET酶CXXC結構域相當的DNA結合基序蛋白。
5、植物5mC氧化衍生物
此前的研究證實，糖基化酶可以通過BER部分途徑直接從DNA骨架上去除5mC修飾，隨之形成一個脫鹼基位點。然而，當擬南芥中已知的去甲基酶發生突變時，並未影響其全局去甲基化程度，甲基化狀態僅在某些特定的位點受到影響。此外，由於一些脫鹼基位點的產生同時使DNA鏈破壞，BER通路可能不是引發基因組不穩定性的基因組整體去甲基化的主要途徑。然而，在配子形成和胚胎發生的生殖過程中，仍不能確定是否存在整體去甲基化。與哺乳動物TET酶的去甲基化途徑相比，植物中是否存在相同的去甲基化途徑?
為了確定植物DNA中是否存在5mC的氧化產物，各種不同靈敏度和特異性的方法隨之用於研究。一系列的研究使用了斑點免疫印跡和液相色譜-多級質譜（LC-MS/MS/MS）等方法來鑒定5hmC的存在，如表1所示。
表1. 利用不同方法研究不同植物組織中基因組DNA(A)和RNA(B)的5hmC含量
擬南芥葉片和花朵中檢測到5hmC修飾的水平占總胞嘧啶的0.07%，暗含該衍生物來源於DNA復制后的被動去甲基化過程。與這一觀點相一致，其他研究觀察到極低水平的5mC迭代氧化，這與哺乳動物中的最低水平(0.15%-0.3%)相當，並認為檢測到的5hmC是由非酶促的DNA去甲基化產生的。另一方面，也有研究認為5hmC的存在是5mC氧化后主動去甲基化的產物，而不是DNA氧化損傷的結果。
此外，在水稻的異染色質區域，特別是轉座元件(TE)相關基因中發現了顯著的5hmC富集。這一結果使研究人員認為染色質結構與5hmC水平之間存在顯著關聯。盡管一些研究結果顯示5hmC來源於植物DNA被動去甲基化，但仍建議進一步研究明確5fC和5caC在內的其他氧化化合物。
基於這些疑問，一項綜合研究運用化學衍生法與液相色譜/串聯質譜分析相結合的方法，測定了擬南芥(A. thaliana)、番茄(Lycopersicon esculentum)、銀杏(Ginkgo biloba)、側柏(Platycladus orientalis)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)等植物樣品中5mC的氧化產物。這項研究結果表明，不同組織基因組DNA中廣泛存在進一步氧化產物，包括5fC和5caC。除了包括DNA糖基化酶途徑結合BER途徑的直接切除外，以上結果使研究者總結為：與哺乳動物DNA去甲基化途徑相似，植物中也存在另一種DNA主動去甲基化的途徑。此外，在干旱和鹽脅迫條件下觀察到植物基因組DNA不同水平的5fC和5caC修飾，暗含這兩種表觀遺傳修飾在環境脅迫條件下的生物學功能。近年來，研究者運用LC-MS/MS研究了包括擬南芥等在內的不同植物RNA的5hmC修飾豐度。這些研究者確認了RNA中存在5hmC，並認為這種5hmC是由活性（酶）轉化導致的，而且，他們認為5mC的氧化產物可能具有關鍵的調控功能。
如前所述，盡管在植物中已經檢測到5mC的氧化產物，但依舊沒有證據證實植物中有類似於哺乳動物TET家族蛋白類似的酶參與其中。在哺乳動物中Tet1、2、3基因功能冗余的證據上面也有陳述。人們普遍認為，這三個基因不存在於多細胞植物中，盡管植物界在許多方面與后生動物和真菌一樣多樣和復雜。Tet基因缺失假說的邏輯推理是不會存在5mC的氧化產物。然而，檢測到5mC氧化衍生物的結果，使我們有必要認識到植物中一定存在另一種蛋白家族，他們負責DNA修飾的形成，他們的生物化學功能跟TET蛋白家族類似，因為氧化中間和末端產物，例如5hmC的存在。
6、轉基因植物表達人源TET蛋白結構域
發現人源TET蛋白家族功能后，研究這些蛋白在植物中表達后的活性成為科學家關注的熱點。第一個發表的研究是將人Tet3基因C端催化結構域，通過35S啟動子控制，轉化到擬南芥中。一個rDNA區域作為甲基化報告基因，研究發現，可以誘導低甲基化或高甲基化模式的等位基因。甲基化模式即使在去除轉基因后也能穩定地保留下來。在TET3轉化株中，檢測到了5hmC標志物，表明轉基因酶具有氧化能力。此外，5fC僅在具有DNA糖基化酶背景下的轉化株中可檢測到，這表明5hmC殘基被人TET催化結構域進一步氧化為5fC。運用相同構思，該研究小組將這項工作擴展到番茄，他們制備了不同表型的轉化株，包括葉片長度和數量的增加。研究者在這些轉化株中發現CEN1.1，磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP) /centroradialis家族, terminal flower和self-pruning (CETS)的各種表達變化。這些變化與該基因在葉片中低甲基化及相應的基因激活有關。
另外三個研究小組發表了類似但更復雜的研究結果。在早期研究中，同樣運用35S啟動子控制人TET1蛋白催化結構域，轉基因到擬南芥中。分析兩個轉化株顯示，基因組整體CG甲基化水平下降，從野生型的18.2%分別下降到8.9%和6.9%。對CHG和CHH的甲基化有較小的影響。后期的第二項研究並未在轉化株中發現5hmC存在的證據。他們認為，5hmC的缺失或許與CG甲基化的降低有關，或體內主動移除了5hmC，或通過BER途徑對產物進一步氧化。盡管不能更好的解釋兩項擬南芥研究結果中5hmC水平的差異，但也可能是TET1和TET3催化結構域活性存在差異。因為對人TET3亞型的研究可知，它們具有不同的表達和底物結合模式。
第二研究小組在植物中表達人TET結構域的研究者運用擬南芥ubiquitin10啟動子介導人TET1催化結構域（TETcd）融合人造鋅指結構（ZF）的融合蛋白的表達，該融合表達的人造鋅指結構用於靶向結合擬南芥FWA基因的啟動子。FWA基因啟動子中胞嘧啶甲基化的缺失可以引起植物可遺傳性開花晚的表型，該表型在TET1轉基因株中同樣觀察到。該研究者同樣構建了ZF-TETcd融合蛋白，靶向作用CACT1轉座子甲基化基因域，同樣進行了靶向去甲基化。此外，他們還開發了一種基於CRISPR/ dcas9的靶向去甲基化。
第三研究小組構建了一種質粒，該質粒將催化失活的SpCas9與人TET3cd（850-1795氨基酸）連接。他們使用了這個質粒的衍生物和四個引導RNA來靶向甘藍的一個特定基因，該基因在小孢子衍生的雙單倍體后代中顯示高甲基化修飾。轉基因后他們的甲基化水平顯著降低，表達顯著升高。
基於上述TET的分子工具，制造感興趣基因的新的等位基因變為可能，同時對於沉默基因的再激活表達、轉基因或轉座也變為了可能。
綜上所述，這四項研究明確表明，人TET催化結構域在植物中表達后具有酶活性，它們可通過氧化5mC產生其它表觀遺傳標記，並產生穩定可遺傳的表型變異。
7、如何在植物中鑒別TET同系物
如上所述，目前在植物中缺乏tet類似酶活功能的證據，那如何更好地探索這方面的證據應該進行很好的分析。目前存在多種觀點陳述如下。首先，所有具有已知或未知底物的植物2-OG加氧酶都可以在異源系統中過表達、純化，然后運用最新的，高分辨率的分析方法和生物信息學方法，對合成的一系列具有不同5mC修飾背景的DNA和RNA進行檢測，以發現已知的5mC衍生物。其次，在擬南芥或存在任何所有已知2-OG加氧酶突變的其它植物中，開展類似地發現5mC衍生物的研究。在這種情況下，有必要進行精細的單細胞或其他微量檢測技術，考慮到TET類似基因可能像在人和其他后生動物（如果蠅）一樣，僅限於在某些特定細胞類型中表達。
對tet類似酶研究提出的第二個問題是，這些酶的氧化功能是否受到進化上不相關的酶的影響。這些酶定義為非同源（類似）、同工異構蛋白質的范疇。換句話說，理論上5mC及其衍生物的氧化可能由2-OG氧化酶以外的氧化酶完成的。
8、總結
盡管上面概述了大量的實驗證據，關於植物中Tet類似蛋白生物學功能的幾個重要問題仍然沒有解決。植物中是否存在TET類似物?在植物5mC氧化過程中，雙加氧酶蛋白在多大程度上具有與TETs相似的保守結構域?這個爭議將科學家划分為兩個主要群體。第一組認為植物中不存在5hmC及衍生物，特別是擬南芥。第二組認為存在5mC衍生物，該衍生物是由酶活去甲基化產生，其過程與哺乳動物途徑類似。期待越來越復雜的分析和分子技術能夠解決這個重要的問題。
參考文獻：doi:10.3934/genet.2019.4.70
1. 項目集錦 | 易基因DNA羥甲基化5hmC測序研究成果
2. BS-miRNA-seq技術發現人類microRNA中CpG和非CpG上的(h)m5C修飾
3. m5C RNA甲基化測序技術---從mRNA到m5C單鹼基分辨檢測
4. 3文聚焦：DNA甲基化對果實成熟的重要作用（橙+番茄+草莓）