前言
植物基因組大小跨越幾個數量級，倍性和雜合性變化，以及新舊基因組轉座子變化等帶來組裝挑戰。三代和物理圖譜提供了新機會，單倍型定相、結構變異分析、從頭泛基因組研究成為新興組裝熱點。
植物基因組發展：
- 擬南芥：sanger BAC-by-BAC。
- shotgun OLC （CELERA assembler）：木瓜、大豆、楊樹等早期測序植物。
- 454/Illumina DBG 短序列高深度帶來植物基因組組裝大爆發，但質量較低。
- 單分子PacBio長度長帶來接近完整染色體組裝。
- 輔助技術發展：Hi-C/BioNano（無需昂貴的BAC物理圖譜）
- ONT納米孔能達上Mb，組裝擬南芥、番茄、高粱、香蕉、甘藍等更連續和完整的版本。
在過去20年種，有400多個植物基因組已發表，包括333個被子植物，15個非被子植物、2個輪藻和44個綠藻。
可查閱：
https://www.plabipd.de/portal/web/guest/sequenced-plant-genomes
1. 單分子長度長測序
PacBio通過CCS產生HiFi 15 kb reads的方法准確率高達99.8％，解決了錯誤率問題，但每條read成本高了近5倍。
基因組測序的發展，在基因組完整度上已經有了很大提升。
2. 長度長基因組組裝的錯誤傾向
新算法的設計目的：correct, overlap, and polish long reads with high error-rates。
算法隨計算設計、速度、內存使用、復雜基因組利用而變化。
- 自糾方法self-correction：CANU、Falcon（phase/unzip）、MARVEL、MECAT。利用reads相互比對，需要較高覆蓋度。
- correction-free：基於OLC的minimap2/miniasm、基於DBG的wtdbg2和Flye。要求更高復雜度的基因組。
組裝的草圖有誤差，必須用高覆蓋度的長讀長或短讀長polish，一般大於三次可達到>99.6%的准確性。
- long reads：Quiver/Arrow (PacBio)、Medaka (ONT)、Nanopolish、Racon。
- short reads：Pilon
PacBio CCS HiFi軟件：Peregrine
3. 物理圖譜技術
- a.Hi-C
- b.Optical maps
4. 解決復雜植物基因組
如下圖，兩條染色體組裝時定相，雜合基因組phasing有如下方法：
- 右上：嵌合假分子，簡化下游分析。
- 右中：原始reads比對到contigs，解決缺失的單倍型區域，建立一個定相的二倍體組裝。
- 右下：保留部分單倍型，並在基於圖的組裝中加以標記。
5. 利用組裝圖
組裝經典指標是N50，或者最短序列長度大於組裝的50%，方法過於簡單。
利用組裝圖可以可視化復雜度和鄰接contig的overlap。
- 純合簡單基因組（左上圖）：理想的graph對於每個contig（節點）只有一條邊和鄰接序列相連。
- 氣泡圖（左下圖）：高雜合性，節點（單倍型）被多條邊連接。
- 復雜重復（右上圖）：在圖結構中較模糊，如rRNA,centromeric satellite DNA。
- 毛團（hairballs，右下圖）：多拷貝重復，無清晰路徑，節點互交。
當參考基因組被泛基因組取代時，基因組圖論將是代表復雜基因組更好的方法。
挑戰和展望
挑戰：
- 多倍體和雜合度
展望：
- 基因組完整、少gap、定相。
- denovo替代重測序，挖掘更多多樣性，用於群體遺傳和泛基因組分析。
- 基因組注釋將落后於組裝，提高注釋質量需要新技術（如全長cDNA，PacBio Iso-seq等）以及新算法。
參考文獻：Todd PMichael. Building near-complete plant genomes. Curr Opin Plant Biol. 2020 Apr;54:26-33.