隨着科學技術的發展,熒光的應用更加的豐富多樣,DIGE技術便是其中之一。DIGE(雙向熒光差異凝膠電泳,Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE),是在傳統雙向電泳的基礎上發展而來的新型蛋白質組學定量技術,其分離蛋白的基本過程與傳統雙向電泳一致。但DIGE使用三種熒光染料(Cy2, Cy3和Cy5)標記不同組別的蛋白,並在同一張凝膠上對標記好的三組蛋白混合物進行電泳分離,是一種多通道分離技術。通常情況下,Cy3和Cy5分別標記兩組蛋白,Cy2標記所有組別蛋白的混合物,作為內參使用。電泳分離后,在激光掃描儀中分別用相應波長的激光進行掃描,這樣在同一張凝膠中便可得到三組蛋白的圖譜。凝膠掃描后,用專用軟件進行分析對比,運用特殊算法,給出准確可靠的定量信息。DIGE在實驗中引入內參,有效地改善了實驗的重復性,大大提高了定量的准確性。
與傳統雙向電泳(銀染或考染膠)相比,DIGE技術服務具有以下優勢:
1、靈敏度高,最低可檢測到125pg的蛋白質;
2、高效性,同一塊凝膠上可以電泳兩個樣品,減輕了工作量;
3、線性范圍更廣,動態范圍高達10-5;
4、定量精確, 采用內標消除了凝膠與凝膠之間的實驗誤差,顯著提高了實驗的精確度和可重復性。
5、統計學分析,DIGE分析軟件自動分析,得到統計結果,降低了操作者之間的偏差。
圖1:DIGE技術流程圖.
DIGE技術流程:1、樣品准備:提取對照組和不同實驗組的蛋白質,定量,Cy3和Cy5標記蛋白,同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后Cy2標記,作為內標。2、蛋白質分離:等量混合三種熒光素標記后的蛋白質,2D-PAGE電泳分離,熒光掃描。3、蛋白質定量分析:用DIGE圖像分析軟件分析同一蛋白質不同處理后的表達量變化。
雙向熒光差異凝膠電泳的熒光掃描分析儀所使用的濾光片有:
Cy2激發濾光片波長480/30nm,發射濾光片波長530/40nm,掃描圖像顏色為藍色;
Cy3激發濾光片波長540/25nm,發射濾光片波長595/25nm,掃描圖像顏色為綠色;
Cy5激發濾光片波長635/30nm,發射濾光片波長680/30nm,掃描圖像顏色為紅色。