Doublets及其形成的原因
單細胞測序期望每個 barcode 標簽下只有一個真實的細胞，但是實際數據中會有兩個或多個細胞共用一個 barcode 的情況，業內稱之為 doublets 或 multiplets（后面統稱為 doublets）。Doublets 形成的原因主要是高通量單細胞測序一般使用液滴微流控（droplet microfluidic）或納米孔（nanowell）技術，細胞被液滴或納米孔捕獲的概率遵循泊松分布規律，doublets 填充液滴的概率會隨着輸入細胞濃度升高而增加。此外，使用磁珠分選細胞，操作不當也會增加 doublets 形成的概率。
一般而言，每個GEMs(Gel Bead in emulsion)會形成如上圖一般的結構，即一個細胞一個gel beads。但有時候也會出現一個GEM里有0或多個細胞(empty droplet or doublet)，對於這種GEMs則需要通過我們在后續分析中識別出來並進行排除。
針對現有幾種檢測單細胞測序doublet的工具的評估文章，系統比較了常見的例如Scrublet、DoubletFinder等工具在檢測准確性、計算效率等方面的優劣，以及比較了使用不同方法去除doublet后對下游DE分析、軌跡分析的影響。
現有的檢測方法，基本都會先構造出虛擬doublet，然后將候選droplet與這些虛擬doublet比較，很相似的那些就定義為doublet。這里的虛擬doublet是通過隨機組合兩個（類）細胞的表達值得到的虛擬的doublet，可以作為檢測時的參照。
在現有的9種方法中(Scrublet、doubletCells、cxds、bcds、Hybrid、DoubletDetection、DoubletFinder、Solo、DoubletDecon)，文章的結論是DoubletFinder的准確率最高。
單細胞實驗的輸入材料通常是生物組織樣品。
第一步，單細胞解離：消化組織產生單細胞懸液。為了分別分析每個細胞中的mRNA，必須分離單細胞。根據實驗方案不同，單細胞分離的方式也有所不同。
基於平板的技術將細胞分到到板上的孔中。
基於液滴的方法則依賴於微流體液滴捕獲單個細胞。
在這兩種情況下，都可能出現一些問題，如多個細胞一起被捕獲（doublets or multiplets）、非活細胞被捕獲或根本沒有細胞被捕獲（空液滴/孔）。基於液滴的方法需要通過低的輸入細胞濃度來保持低的doublets率，因此空液滴是特別常見的 （生信寶典注：一般beads和細胞的輸入比例是20:1）。
每個孔或液滴均包含必要的試劑以裂解細胞膜並進行文庫構建 (生信寶典注：植物單細胞就要注意了，需要提前去除細胞壁)。文庫構建包括捕獲細胞內mRNA、反轉錄為cDNA分子並進行擴增等過程。因為文庫構建時每個細胞是獨立的，所以每個細胞的mRNA也就特異的標記了孔特異性或液滴特異性細胞barcode。此外，許多實驗方案還使用唯一分子標識符（UMI）標記捕獲的RNA分子。一般在測序之前需要先擴增細胞cDNA以增加其被檢測的可能性。但微量擴增更容易引入PCR偏好性。UMI使我們能夠區分測到的reads是來源於mRNA分子的不同擴增拷貝還是來源於獨立的mRNA分子，從而可以進行更准確的定量。
每個細胞單獨構建的cDNA文庫都帶有cell barcode和/或UMI（取決於protocol），后續將這些文庫混合在一起測序。測序產生的reads數據進行質量控制 ，根據其barcodes序列分組（demultiplexing），並且進行后續比對定量。對基於UMI的protocols，reads的數據可以進一步demultiplexed以得到捕獲的mRNA分子的計數（count data）。也就是本套流程的起始輸入數據。
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