今天介紹的這一篇文獻[
Ref1]，發表在NC上，中規中矩，分析內容很全面也很常見（話說，NC上面好多這種描述性的單細胞文章）。
下面我會簡單介紹一下文獻內容，涉及到以下內容，大家可能會感興趣：
- 這篇文章是如何鑒定腫瘤細胞的？（我之前專門寫過一篇推文講這個）
- 腫瘤細胞和非腫瘤細胞一起降維聚類時，需不需要去批次？
- 腫瘤細胞的異質性可以從哪幾個角度說明？
- 腫瘤細胞的擬時序/軌跡分析怎么做？
- monocle2的經典圖怎么看？
- 細胞通訊分析怎么做？有哪些經典的受配體對？
后台回復20210528獲取完整PPT及文獻原文
1. 背景
我們從標題中大概能知道這篇文獻的主要工作是集中在晚期NSCLC的腫瘤異質性、腫瘤微環境。去年的統計數據顯示肺癌已經是我國發生率和死亡率最高的癌症。
大家做單細胞的原因很多時候都是為了解決異質性的問題，為什么用葯之后有的人有效而有的人沒效，為什么剛開始有效過段時間又沒效，這其中根本的原因就在於異質性，腫瘤細胞本身有異質性，周圍的微環境也有異質性。最終的願景是希望在完全了解透這些異質性后，能給患者分組，每一組給予特定的治療方案。
2. 實驗設計和初步結果
這張圖顯示了這篇研究的樣本組成，有肺腺癌 肺鱗癌，有三期 四期，他們是否吸煙，有無致癌突變。這個圖的展示形式還挺清晰的。
左上圖展示了鑒定出來的11種主要的細胞類型，需要注意的是，這里面把Cancer和Epithelial、Alveolar是區分開的，也就是說腫瘤取樣也可能含有正常的上皮細胞。這篇文章里面鑒定腫瘤細胞，方法非常簡單，首先得是上皮細胞(高表達EPCAM)，然后不表達肺部組織正常上皮細胞的marker。比我之前講的方法簡單多了，准確性如何呢，我持保留意見，不過下文的CNV熱圖我們可以看到有一些病人所有腫瘤細胞是幾乎沒有CNV的。
左下圖是病人來源信息，從圖中可以看出，這張圖是沒有去批次效應的。原因有兩個：一是對於非腫瘤細胞的亞群，不同病人聚類比較好，二是在這張圖中，不想抹掉腫瘤細胞的腫瘤間異質性。這是原文的解釋，我也很贊同，所以當你遇到腫瘤細胞、非腫瘤細胞一起聚類的情況，可以不去批次。非腫瘤細胞單獨拿出來聚類就另說了。
右邊兩張圖就比較常規了，marker基因熱圖（之前總結過展示marker基因的幾種圖，第一篇、第二篇），細胞亞群占比。
3. 解析腫瘤異質性
3.1 腫瘤間異質性
a圖是根據腺癌、鱗癌，有無突變分組后，比較CNV（前面寫過三篇inferCNV相關的帖子，學完可以畫出更好看的CNV熱圖）。作者發現肺腺癌在chromosome 7 and 8q有擴增，在chromosome 10有缺失；肺鱗癌在3q有擴增，在5q有缺失。該結論並不是在所有病人中都成立。
b圖c圖一起看，C圖是說這些腫瘤細胞可以聚成20類，b圖說的是每一個病人中，每個cluster的占比。從b圖可以看出在多數的肺腺癌中（圖的右邊1/3的樣本）會聚到一起（很像），並且每個病人中只有一個主要的cluster；而肺鱗癌病人之間沒有那么像，並且好幾個病人有多個cluster。這說明肺鱗癌有更高的腫瘤間異質性，以及更高的克隆性。
這一部分是腫瘤間異質性：腺癌鱗癌之間，病人之間。
3.2 腫瘤內異質性
為了定量腫瘤內部的異質性(ITH)，作者定義了兩個ITH分數，一個基於表達矩陣得到ITH_GEX，一個基於inferCNV輸出的矩陣得到ITH_CNA。在矩陣中，所有細胞兩兩之間算一個相關系數，對於這些數值的分布，0.75分位數減去0.25分位數就得到這個分數。左圖顯示這兩個ITH分數有一定的相關性，但不強，因為CNV雖然可以影響基因表達，但基因表達還受很多其他因素的調控，比如TF、小RNA、點突變、與周圍環境的細胞互作等等。
右圖比較了不同分組之間的ITH分數。
4. 正常上皮細胞到腫瘤細胞的軌跡分析
關於腫瘤細胞的擬時序，我見過正常上皮細胞和腫瘤細胞放在一塊來分析的，幾乎沒有見過腫瘤細胞單獨做擬時序，而且我也覺得這樣做沒什么道理，我覺得腫瘤細胞不同狀態是一種優勝劣汰的關系，不同狀態之間是否會相互轉變感覺不是很明確（我沒說EMT, CSC這種線性的轉變），所以即使做了擬時序結果也不一定可靠。
- 如果正常上皮細胞之間的發育軌跡已經清楚，將其作為參考，和腫瘤細胞一起做軌跡分析，可以知道正常上皮細胞發育的哪些階段更容易發展成腫瘤細胞（其實這種情況，從表達譜相似性也能看出來，之所以還要這么做，可能是因為大家覺得軌跡分析看上去高大上一些），比如
Ref2中的Fig. 2b； - 如果正常上皮細胞（多種）向腫瘤細胞進展的關系已經清楚，通過做軌跡分析，可以完善已知路徑，明確幾種正常上皮細胞是如何發展成腫瘤細胞的，可能是獨立的，也可能存在中間狀態；也可以同上面一樣，看看別的上皮細胞是否也容易發展成腫瘤細胞。
這篇文章是第二種情況，以圖中肺鱗癌為例。已知basal cells和club cells可以發展成LUSC腫瘤細胞，做完monocle2發現club cells處在更末端的位置，basal cells處在靠近club cells的枝干上，腫瘤細胞分布在其余位置，因此可以將已知的路徑改寫成：basal cells似乎是club cells向腫瘤細胞轉變的中間狀態（原文似乎這個詞用得太好了，沒把話說絕，也省了實驗驗證，我學廢了）。
5. Th17和Treg潛在的轉變
文章說這是首次在肺癌中找到Th17細胞亞群，並揭示了Th17和Treg潛在的轉變關系（之前已經被報道過）。
d圖是用Slingshot做的，顏色深淺表示擬時序的先后，Th17和Treg之間被連起來，說明存在轉換關系。
右邊的分支圖和熱圖是monocle2畫的，之前剛學monocle2的時候，比較疑惑的是熱圖里面的fate1和fate2分別表示什么，這張圖就說得很清楚了。從你想研究的節點（圖中的1節點）到根（一般是人為指定，圖中是CD4 naive對應的狀態）都是pre-branch，然后沿着擬時序的方向（跟你指定的根狀態有關），右邊的枝是fate1（對應圖中的增殖細胞），左邊的枝是fate2（對應Treg細胞）。熱圖里面選了一些pre-branch、fate1、fate2對應細胞的差異基因來呈現，從熱圖中間向兩邊看，能看到不同的fate表達不同的基因。文中說，從圖中可以看出Th17是沿着naive到Treg的中間狀態。
結合這兩種方法，得出Th17和Treg有潛在的轉變關系。
6. TME中的免疫細胞組成
在解析了腫瘤細胞、重要免疫細胞之后，作者又看了每個病人中細胞亞群的占比，並探究了哪些因素能影響細胞占比。
a圖是說，不同的分組影響中性粒細胞的占比，文章是將中性粒細胞作為一種免疫抑制的亞群來說的。
d圖是說，隨着異質性分數的增加，幾種免疫抑制的亞群占比增加，漿細胞亞群占比減少。（漿細胞分泌抗體對腫瘤細胞有一定的殺傷作用，可以通過介導NK細胞，或是激活補體系統等途徑，不過抗腫瘤免疫平時說得比較多的還是T細胞殺傷這種細胞免疫方式。）
因此作者得出結論，認為ITH升高，會增加免疫抑制微環境，降低腫瘤殺傷能力。
7. 細胞通訊分析
文章的最后一部分講的是細胞通訊，雖然作者說不同的分組有不同的細胞間通訊網絡，但從文中給的圖來看，幾組都整體差不多，有個別差異。
如果用過cellphoneDB，會發現輸出結果里面有統計學意義的受配體對很多很多，之前比較兩組的受配體對，試過肉眼比較兩張大熱圖一個一個看，太花時間了，后來就干脆提前整理好想要比較的受配體對（文章里面經常出現的受配體對就那些），直接從輸出文件里面提取，省事很多。
比如，我圖中圈出來的幾個，
- 趨化因子及其受體，說明腫瘤細胞會招募中性粒細胞這種免疫抑制的亞群；
- VEGFA相關的受配體，說明腫瘤細胞會促進血管生成（內皮細胞），保證自身營養供應；
- Treg表達CTLA4分子，巨噬細胞（作為抗原提呈細胞APC）表達CD86，二者結合，那么能給CD8提供抗原的APC就少了，從而減少CD8的激活；
- 耗竭性CD8 T細胞表達CTLA4是一個特征，與APC表達的CD86結合后，啟動抑制性信號。
8. 總結
最后總結一下，我覺得的這篇文章的亮點：
- 填補了晚期非小細胞肺癌單細胞轉錄組領域的空白
- 文章第一次在NSCLC中發現了Th17，並揭示了Th17和Treg的潛在轉變關系
- 從多個角度解析了腫瘤的異質性（腫瘤間、腫瘤內都做了分析）
- ITH與免疫抑制微環境的關系
9. Ref
- Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer
- Lee, H. O., et al. (2020). "Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer." Nat Genet 52(6): 594-603.
OK啦，這篇文獻就說到這里，歡迎三連哈~
因水平有限，有錯誤的地方，歡迎批評指正！