鏈特異性轉錄組測序
非鏈特異性轉錄組測序信息不包含鏈方向的特征信息，對正義和反義轉錄本無法准確判斷，導致無法反映真實的轉錄情況。而鏈特異性轉錄組測序（strand-specific RNA seq）可以解決這個問題。鏈特異性建庫的方式是在合成cDNA的第二條鏈時，用dUTP替換dTTP。待鏈合成后，再用USER酶降解cDNA的第二條鏈並再次進行PCR擴增，完成文庫的制備。運用這種方法，可以在測序后的數據分析過程中確定轉錄本是來自正義還是反義DNA鏈。與非鏈特異性轉錄組測序相比，此方法更能准確地統計轉錄本的數量和確定基因的結構，同時可以發現更多的反義轉錄本，目前被廣泛地應用於研究基因結構和基因表達調控等領域范圍。
鏈特異性建庫根據原核生物或真核生物的不同，建庫方式略有差別。同時，鏈特異性建庫既可以用於有參物種的轉錄組測序也可用於無參物種的轉錄組測序。
技術路線
有參考基因組的轉錄組測序
無參考基因組的轉錄組測序
技術優勢
測序策略
| 測序策略 | PE100或PE125 |
| 建議數據量 | 真核生物：一般測序5-6G深度測序10G 原核生物：一般測序1G深度測序5-10G |
收樣要求
| 組織 | 500mg新鮮植物樣本，300mg新鮮動物樣本注: 腫瘤組織優先選擇RNAlater保存 |
| 細胞 | >5*106懸浮/貼壁細胞 |
| 血液 | >3ml全血/全血分離的有核細胞 |
| RNA總量 | >3μg，濃度 >50ng/μl, RIN值>6.5 |
| 對於較難進行取材的醫學類樣品，可以適當降低樣本標准。 | |
您可以得到的數據分析
有參鏈特異性轉錄組測序生物信息學分析流程
| 常規分析 | 高級分析 |
| 高通量序列與參考基因組比對 測序數據質控分析 基因表達量分析 基因的可變剪切分析(真核生物) 基因結構優化及新轉錄本預測 SNP、InDel等基因結構變異篩查 鏈方向性分析 樣本間基因差異表達分析 差異表達基因的KEGG和GO功能分析 |
鏈特異性相關的定制分析 差異基因的蛋白互作分析 個性化定制分析 |
無參鏈特異性轉錄組測序生物信息學分析流程
| 常規分析 | 高級分析 |
| 測序數據質控分析 參考序列拼接 Unigene的長度統計及功能注釋 Unigene的表達譜構建 SSR分析 ORF預測 SNPs分析 序列信息統計 鏈方向性分析 Unigene在樣本之間各類差異基因表達 Unigene的KEGG和GO功能分析 |
鏈特異性相關的定制分析
差異基因的蛋白互作分析 個性化定制分析
|
案例解析
(有參鏈特異性轉錄組測序)
闡明新型的轉錄本和其順式天然反義轉錄本（cis-NATs）的表達情況對於研究植物在應對和適應各種脅迫所發生的代謝過程是十分必要的。非鏈特異性轉錄組測序無法提供鏈方向的信息，因此在鑒定cis-NATs的過程中，必須采用鏈特異性轉錄組測序。本研究探索鉻處理大米樣品中cis-NATs的表達情況和其對應轉錄本在應對鉻脅迫中起到的作用。結果表明，許多cis-NATs都體現出了上調或者下調的趨勢，35個與cis-NATs相關的基因位點在鉻處理后的不同的組織和時間點組合顯示了上調反應，表明cis-NATs根據環境變化而變化。雖然cis-NATs和RAP （大米基因注釋數據庫）轉錄本的對應並非絕對明確，然而通過證明cis-NATs和大米的鉻脅迫代謝反應相關，提升了對植物環境脅迫反應的分子層面認知。
Oono, Youko, et al. "Genome-wide analysis of rice cis-natural antisense transcription under cadmium exposure using strand-specific RNA-Seq." BMC genomics 18.1 (2017): 761.(Impact factor：3.73)
A. 鉻處理24小時后表達上調的大米基因區域：Os05g0194500（紅色標示）
B. 鏈特異性測序轉錄本的GO富集圖，不同顏色代表不同的GO功能
小鼠卵母細胞的深度測序和重新組裝揭示轉錄作用對DNA甲基化起到的影響
(無參鏈特異性轉錄組測序)
先前研究並沒有清晰地闡述在小鼠卵母細胞中轉錄作用對DNA甲基化產生的影響，原因之一是沒有應用鏈特異性測序方法，無法體現轉錄本的方向和確定可變的轉錄起始位點。本研究系統的探究了小鼠卵母細胞中轉錄組與DNA甲基化的關系，利用鏈特異性轉錄組測序和轉錄組重新組裝的方法對小鼠卵母細胞形成的不同階段（不生長期，生長期，8-14天，15天和完全生長的卵母細胞）進行了研究，揭示了上千個全新的mRNAs和可變啟動子。重新組裝后的轉錄組數據揭示了轉錄作用的確與DNA甲基化密切相關，受轉錄作用調控的DNA甲基化占全部甲基化作用的85-90%。后續通過結合甲基化檢測，ChIP-seq等方法，准確的定義了小鼠卵母細胞的轉錄組。本研究不僅在小鼠卵母細胞發生過程中將轉錄作用與DNA甲基化建立了聯系，同時也進一步地完善了小鼠卵母細胞的轉錄組圖譜。
Veselovska, Lenka, et al. "Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape." Genome biology (2015): 209. (Impact factor:11.9）
A. 鏈特異性轉錄組測序后的生物信息學分析流程，上方信息為不同卵母細胞發育時期（N.G.O, G.O.1等），右邊的條形圖為各項分析后的轉錄本數量。
B. 不同樣品（卵母細胞，不同時期胚胎等）中轉錄本的表達聚類分析，左邊豎條代表卵母細胞中特異表達的轉錄本（紫色）和非特異表達的轉錄本（黃色）。
研究趨勢與研究熱點
研究順式天然反義轉錄本(cis-NATs)；
無參考基因組或參考基因組不全的物種轉錄組圖譜的構建或完善。
常見問題
鏈特異性建庫和非鏈特異性建庫有什么區別？
1.鏈特異性文庫可以提供RNA方向信息，以區分轉錄本是來源於正義鏈還是反義鏈，避免了其互補鏈轉錄本重疊的干擾，使得基因定量更精確；2.鏈特異性文庫可以提高反義鏈上非編碼轉錄本的檢出率，同時也便於確定那些位於基因間的非編碼轉錄本的方向，這一點在普通轉錄組建庫方法上很難實現；
3.預測新轉錄本時需要進行組裝，而轉錄組組裝出來的unigene包含編碼轉錄本和非編碼轉錄本（如lncRNA），如果不區分其轉錄本是正義鏈還是負義鏈，那么有互補配對關系的編碼與非編碼轉錄本就會被組裝成一條轉錄本；
4.原核生物的基因為多順反子結構，如果不加區分反義轉錄本上的基因，其對應位置的基因表達量會計算不准確，操縱子及基因結構的預測也隨之不准確。