FastQC

1、下載fastqc

wget  http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.5.zip

2、解壓

unzip fastqc_v0.11.5.zip

 

3、 給予執行權限，否則執行的時候會顯示沒有權限

cd FastQC
chmod 755 fastqc

 

4、加入到PATH

export PATH=/home/h/FastQC/:$PATH

 

5、測試

fastqc --help

使用例子

fastqc -o ./tmp.result/fastQC/ -t 6 ./ tmp.data/fastq/H1EScell-dnase-2014-GSE56869_20151208_SRR1248176_1.fq

# -o --outdir FastQC生成的報告文件的儲存路徑，生成的報告的文件名是根據輸入來定的

# -t --threads 選擇程序運行的線程數，每個線程會占用250MB內存，越多越快咯

 

 

FastQC的報告介紹

整個報告分成若干個部分。合格會有個綠色的對勾，警告是個“!”，不合格是個紅色的叉子

 

基本信息

# Encoding指測序平台的版本和相應的編碼版本號，這個在計算Phred反推error P的時候有用

# Total Sequences記錄了輸入文本的reads的數量

# Sequence length是測序的長度

# %GC是我們需要重點關注的一個指標，這個值表示的是整體序列中的GC含量，這個數值一般是物種特異的，比如人類細胞就是42%左右

 

序列測序質量統計

# 此圖中的橫軸是測序序列第1個鹼基到第101個鹼基

# 縱軸是質量得分，Q = -10*log10（error P）即20表示1%的錯誤率，30表示0.1%

# 圖中每1個boxplot，都是該位置的所有序列的測序質量的一個統計，上面的bar是90%分位數，下面的bar是10%分位數，箱子的中間的橫線是50%分位數，箱子的上邊是75%分位數，下邊是25%分位數

# 圖中藍色的細線是各個位置的平均值的連線

# 一般要求此圖中，所有位置的10%分位數大於20，也就是我們常說的Q20過濾

# 所以上面的這個測序結果，需要把后面的87bp以后的序列切除，從而保證后續分析的正確性

# Warning 報警 如果任何鹼基質量低於10，或者是任何中位數低於25

# Failure 報錯 如果任何鹼基質量低於5，或者是任何中位數低於20

 

每個tail測序的情況

# 橫軸和之前一樣，代表101個鹼基的每個不同位置

# 縱軸是tail的Index編號

# 這個圖主要是為了防止在測序過程中，某些tail受到不可控因素的影響而出現測序質量偏低

# 藍色代表測序質量很高，暖色代表測序質量不高，如果某些tail出現暖色，可以在后續分析中把該tail測序的結果全部都去除

 

每條序列的測序質量統計

# 假如我測的1條序列長度為101bp，那么這101個位置每個位置Q值的平均值就是這條reads的質量值

# 該圖橫軸是0-40，表示Q值

# 縱軸是每個值對應的reads數目

# 我們的數據中，測序結果主要集中在高分中，證明測序質量良好！

 

GC 含量統計

# 橫軸是1 - 101 bp；縱軸是百分比

# 圖中四條線代表A T C G在每個位置平均含量

# 理論上來說，A和T應該相等，G和C應該相等，但是一般測序的時候，剛開始測序儀狀態不穩定，很可能出現上圖的情況。像這種情況，即使測序的得分很高，也需要cut開始部分的序列信息，一般像我碰到這種情況，會cut前面5bp

 

序列平均GC含量分布圖

# 橫軸是0 - 100%； 縱軸是每條序列GC含量對應的數量

# 藍色的線是程序根據經驗分布給出的理論值，紅色是真實值，兩個應該比較接近才比較好

# 當紅色的線出現雙峰，基本肯定是混入了其他物種的DNA序列

# 這張圖中的信息良好

 

序列測序長度統計

# 每次測序儀測出來的長度在理論上應該是完全相等的，但是總會有一些偏差

# 比如此圖中，101bp是主要的，但是還是有少量的100和102bp的長度，不過數量比較少，不影響后續分析

# 當測序的長度不同時，如果很嚴重，則表明測序儀在此次測序過程中產生的數據不可信 

 

序列Adapter

# 此圖衡量的是序列中兩端adapter的情況

# 如果在當時fastqc分析的時候-a選項沒有內容，則默認使用圖例中的四種通用adapter序列進行統計

# 本例中adapter都已經去除，如果有adapter序列沒有去除干凈的情況，在后續分析的時候需要先使用cutadapt軟件進行去接頭

 

重復短序列

# 這個圖統計的是，在序列中某些特征的短序列重復出現的次數

# 我們可以看到1-8bp的時候圖例中的幾種短序列都出現了非常多的次數，一般來說，出現這種情況，要么是adapter沒有去除干凈，而又沒有使用-a參數；要么就是序列本身可能重復度比較高，如建庫PCR的時候出現了bias

# 對於這種情況，我的辦法是可以cut掉前面的一些長度，可以試着cut 5~8bp