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FastQC 的使用
FastQC的安裝介紹請看這里。FastQC 支持 fastq、gzip 壓縮的 fastq、SAM、BAM 等格式，在不指定文件類型的情況下，FastQC 會根據文件的名字來推測文件的類型: 以 .sam 或者 .bam 結尾的文件會被當作 SAM/BAM 文件來打開，並統計 mapped 和 unmapped reads 在內的所有 reads；其它的文件類型則被當作 fastq 格式打開。 其使用語法為：
fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] [-t threads] seqfile1 .. seqfileN
-o 用來指定輸出文件的目錄，需要注意的是，FastQC 不會自動創建新目錄，故指定的目錄必須存在；
FastQC 輸出結果為 .zip 文件，默認參數為 --extract (自動解壓縮)，執行時加上 --noextract 則不解壓縮；
-f 用來指定輸入文件格式，如果不指定則自動檢測；
-c 用來指定一個文件，這個文件里面存放可能存在的污染序列，FastQC 會在這個文件里面搜索 reads 中的 overrepresented sequences；
-t 用來指定同時處理的文件個數；
seqfile1 等是需要處理的文件名稱；
詳細信息請見 fastqc -h 或者 fastqc --help；
我用來分析的命令為 fastqc --noextract -t 2 sample_R1.fq.gz sample_R2.fq.gz -o ./00.FastQC
FastQC 結果解讀
上一期我簡單地提了一下 FastQC 結果的基本內容，在思考之后，決定把結果中每部分內容給大家仔細解讀一下。如圖 2 所示：FastQC 的結果包含 12 個方面，其中綠色的結果表示“通過”；黃色的結果表示“警告”；紅色的結果表示“不合格”。我們應關注結果中未通過的部分，仔細思考為什么我們的數據會得到這樣的結果，可能存在哪些問題？下面我們分別看一下各部分結果的內容，以及 FastQC 判斷各部分結果通過、警告和不合格的閾值是什么
1. Basic Statistics
Basic Statistics 的結果給出原始數據的基本信息，包括被分析文件的文件名、文件類型 (actual base calls/colorspace data)、質量值編碼方式、序列總數、標記為低質量的序列數、序列長度 和 GC 含量，如圖 3 所示：
圖 3 Basic Statistics
Basic Statistics 的狀態始終都是“通過”，不會出現“警告”或者“不合格”；
這部分結果提供了鹼基質量值編碼方式，可以記錄下來，在后續的分析中會用到。
2. Per Base Sequence Quality
Per Base Sequence Quality 顯示 fastq 文件內每一個位置上 (x 軸) 所有鹼基的質量值范圍 (y 軸)，如圖 4 所示：
圖 4 Per Base Sequence Quality
圖中每一位置都有一個 BoxWhisker 圖: 黃色箱子表示 25 - 75 % 的范圍，即 IQR (inter-quartile range)，下面和上面的觸須分別表示 10 % 和 90 % 的點。藍線表示均值，紅線表示中位數；
鹼基的質量值越高越好，背景顏色將圖分成三部分：鹼基質量很好 (綠色)、鹼基質量一般(黃色) 以及鹼基質量差 (紅色)。
如果任何一個位置的下四分位數小於10或者中位數小於25，會顯示“警告”；如果任何一個位置的下四分位數小於5或者中位數小於20，會顯示“不合格”。
3. Per Tile Sequence Quality
只有在分析 Illumina 測序結果且保留了序列 ID 信息 (@HWI-D00523:75:C4PY7ANXX:2:1101:1316:2178，見上一講 fastq 格式介紹) 時才會有這部分結果出現。為了更好的理解這部分的內容，我先簡單的介紹一下 flow cell 的構成 (圖 5): 圖中所示的 flow cell 有八個 lane (lane1 - lnae8)，每個 lane 里面有 3 列 (column1 - column3)，每一列內有100 個 tiles，每個 tile 里面又有 20000 - 30000 個 clusters (不同型號 flow cell 內的 column 數、tile 數及 cluster 數會有一定的差異)。
圖 5 flow cell 的構成
Per Tile Sequence Quality 的結果展示每個 tile 在每個鹼基位置上偏離這個位置所有 tiles 平均質量值的情況，如圖 6 所示：
圖 6 Per Tile Sequence Quality
圖中橫軸代表鹼基位置，縱軸代表 tile 編號；
圖中的顏色是從冷色調到暖色調的漸變，冷色調表示這個 tile 在這個位置上的質量值高於所有 tile 在這個位置上的平均質量值，暖色調表示這個 tile 的在這個位置上的質量值比其它 tiles 要差；
一個很好的結果，整張圖都應該是藍色；
如果任何 tile 的平均質量值與這個位置上所有 tiles 的平均質量值相差 2 以上會顯示“警告”，如果任何 tile 的平均質量值與這個位置上所有 tiles 的平均質量值相差 5 以上會顯示“不合格”。
4. Per Sequence Quality Scores
Per Sequence Quality Scores 顯示每條序列平均鹼基質量的分布，如圖 7 所示：
圖 7 Per Sequence Quality Scores
圖中橫軸為測序質量值，縱軸為 reads 數量；
由於成像的原因，得到的測序結果中通常會出現某些 reads 的質量值偏低，這樣低質量的 reads 會在圖中出現另外一個峰。本圖顯示的是一個較好的測序結果；
如果最高峰的質量值小於 27 (錯誤率 0.2 %) 則會顯示“警告”，如果最高峰的質量值小於 20 (錯誤率 1 %) 則會顯示“不合格”。
5. Per Base Sequence Content
Per Base Sequence Content 顯示每個位置上的鹼基組成比例，如圖 8 所示：
圖 8 Per Base Sequence Content
圖中橫軸為鹼基位置，縱軸為鹼基組成比例；
一個完全隨機的文庫內每個位置上 4 種鹼基的比例應該大致相同，因此圖中的四條線應該相互平行且接近；
在 reads 開頭出現鹼基組成偏離往往是我們的建庫操作造成的，比如建 GBS 文庫時在 reads 開頭加了 barcode；barcode 的鹼基組成不是均一的，酶切位點的鹼基組成是固定不變的，這樣會造成明顯的鹼基組成偏離；
在 reads 結尾出現的鹼基組成偏離，往往是測序接頭的污染造成的；
如果任何一個位置上的 A 和 T 之間或者 G 和 C 之間的比例相差 10 % 以上則報“警告”，任何一個位置上的 A 和 T 之間或者 G 和 C 之間的比例相差 20 % 以上則報“不合格”。
6. Sequence GC Content
Per Sequence GC Content 顯示每條序列平均 GC 含量的分布，如圖 9 所示:圖 9 Per Sequence GC Content
在一個正常的隨機文庫中，GC 含量的分布應接近正態分布，且中心的峰值和所測基因組的 GC 含量一致。由於軟件並不知道所測物種真實的 GC 含量，圖中的理論分布是基於所測數據計算得來的；
如果出現不正常的尖峰分布 (如本圖)，則說明文庫可能有污染 (如果是接頭的污染，那么在 overrepresented sequences 那部分結果還會得到提示)，或者存在其它形式的偏選；
如果偏離理論分布的 reads 數超過總 reads 數的 15 % 則報“警告”，如果偏離理論分布的 reads 數超過總 reads 數的 30 % 則報“不合格”。
7. Per Base N Content
Per Base N Content 顯示每個位置上的 N 的比例，如圖 10 所示:
圖 10 Per Base N Content
在測序儀工作過程中，如果不能正常完成某個鹼基的 calling，將會以 N 來表示這個位置的鹼基，而不是 A、T、C、G；
有時在序列中會出現較低比例的 Ns，尤其是靠近序列末端的位置，這說明系統不能正常的 call 這部分鹼基；
出現一定比例的 Ns 最常見的原因是普遍出現的質量丟失 (a general loss of quality)，這種情況可結合其它部分的結果來綜合判斷；
另一種常見的現象是文庫整體上的測序質量較高，但 reads 開頭出現較高比例的 N，這可能是由於文庫的鹼基組成偏離的比較嚴重，測序儀不能給出正確的 call，這種情況可以結合 per-base sequence content 的結果來判斷；
如果任何一個位置 N 的比例大於 5 % 則報“警告”，大於 20 % 則報“失敗”。
8 Sequence Length Distribution
Sequence Length Distribution 的結果顯示 reads 長度的分布情況，如圖 11 所示：
圖 11 Sequence Length Distribution
測序儀出來的原始 reads 通常是均一長度的，但經過質控軟件等處理過的數據則不然；
當 reads 長度不一致時報“警告”，當有長度為 0 的 reads 時則報“不合格”。