單細胞測序之質控分析（QC）
為什么要做質控？
在細胞分離過程中的細胞損傷或者文庫制備的失敗（無效的逆轉錄或者PCR擴增失敗），往往會引入一些低質量的數據。這些低質量的數據的主要特點是（以下一行表示一個基因，一列表示一個細胞）：
- 細胞整體上的counts值少（從列的角度看，一列數據的總和偏小）
- 基因的低表達（從行的角度看，一行數據普遍過小）
- 線粒體基因或者spike-in的比例相對較高
如果這些損傷的行或者列，沒有被移除的話，可能會對下游的分析結果產生影響（比如：歸一化，差異表達，細胞分類等）。所以我們在進行分析之前，一定要先移除這些低質量的行與列。
質控的指標
以下一行表示一個基因，一列表示一個細胞：
每一個細胞所有基因的counts值之和（一個細胞中的count之和過小；列上數值普遍過小）
在文庫制備的過程中，可能因為細胞的裂解或cDNA捕獲和擴增效率的低下，而使得RNA的丟失。具有較小的counts值之和的細胞被認為是低質量的細胞，考慮去除。
每一個細胞中單個基因的表達數量（一個基因在各個細胞中表達過低；行上數值普遍過小）
多樣化的轉錄本如果沒有被成功的捕獲到，因此任何一個細胞中有很少的基因表達，被認為是低質量的，考慮去除。
每一個細胞中，spike-in序列/線粒體基因占總的counts值的比例
每個細胞中添加的spike-in序列（人為添加的表達量的參照系）的濃度都是等量的。如果spike-in的比值很高，那么就意味着在實驗的過程中，大量的轉錄本丟失。
同樣的，線粒體基因的高比例，也意味着這可能是由於穿孔細胞的細胞質RNA丟失，從而產生低質量的細胞。理由是，在存在適度細胞損傷的情況下，細胞膜上的孔允許單個轉錄物分子外排（丟失），但過小而無法使線粒體逸出，從而導致線粒體轉錄物的相對富集。
低質量細胞的影響
細胞破壞后，可能會導致線粒體或核RNAs占比升高（大量細胞質中mRNA流失，而線粒體或核RNAs含量基本不變），很有可能會根據這個結果形成自己的一個個cluster。
低質量的細胞一般文庫比較小，而差異分析之前一般對文庫大小進行一個歸一化。比如正常細胞文庫大小是100，某個基因表達量是2；損傷細胞的文庫大小是10，這個基因表達量還是2。歸一化后，損傷細胞中的這個基因表達量計算結果明顯會高於正常細胞，呈現一種“本來不優秀，但班里人少了，排名就上升”的狀態。
細胞損傷可能會伴隨RNA的流失，因此許多基因可能會被認為“下調”，尤其體現在細胞質核糖體RNA（另外還包括一些細胞質轉錄本）。
影響方差估計和PCA結果。真實情況下，可能一個基因在兩個細胞中差異並不顯著，但是由於其中一個細胞質量低，導致基因表達量在這兩個細胞中差異明顯；反映在PCA結果就是：前幾個主成分會抓取細胞質量的差異，因為這種差異體現得更明顯，而將真正的生物學因素放到了后面幾個主成分中，因此得到的PCA結果其實也只是反映了細胞質量的差異，而非真正的生物學差異。
如果一個細胞群體異質性較高，那么很有可能一些高質量細胞本身表達的數量就是比其他細胞少，但事實上它不是技術誤差造成的。因此不能通過一個固定的閾值進行過濾，而要“因地制宜”，根據每群細胞各自的特性（比如各自的中位值），然后結合一定的統計指標（例如3倍的MAD）
過濾的細胞會不會屬於某一個具有生物意義的細胞類群，如果真的是，那么就會有相應的marker基因高表達。
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https://blog.csdn.net/weixin_40640700/article/details/114538295
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https://www.plob.org/article/20886.html
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