三、單細胞測序原理
今天主要介紹單細胞測序原理。10X Genomics和BD Rhapsody是目前單細胞測序的兩大主流平台，所以今天的單細胞測序原理介紹也是基於這兩個平台的。
（1）10X Genomics單細胞測序原理
上圖是10X單細胞測序的原理圖。首先要說明的是，單細胞測序和Bulk RNA-seq測序的區別，並不是測序本身的區別，它們同樣是基於二代測序技術進行的測序，它們的區別主要是體現在前期對細胞的處理上。
我們從上圖可以看出，10X的單細胞測序需要經過一個雙十字系統，經過這個系統才能達到單細胞水平的捕獲。在圖最左邊是帶有標記的凝膠微珠，在這個系統中凝膠微珠沿着橫向通道向右流動。在第一個十字交叉的地方，放進去細胞懸液和酶，這里的細胞是提前制備的單細胞的懸液。在第一個十字位置，凝膠微珠和細胞及相關酶相遇，一起向右流動。在第二個十字位置，與油相遇，形成一個個包裹着凝膠微珠和細胞的油珠，一起到右邊的位置，被收集起來。這樣一個細胞和一個凝膠微珠在一起，並處在獨立的空間內。
當這樣包裹一個細胞和一個凝膠微珠的油珠被收集之后，細胞就會在酶的作用下破裂，釋放出細胞內的RNA，這些RNA就會連接到凝膠微珠上。那為什么釋放出來的RNA會連接到凝膠微珠上呢？我們看下邊這個圖。
原來在凝膠微珠表面覆蓋了一層短的核酸序列，這些短的核酸序列都是由4部分構成：R1、10X Barcode、UMI和Poly(dT)VN。其中Poly(dT)VN部分是富集T（胸腺嘧啶）的序列，我們知道在RNA的3'末端有一個polyA的尾巴，所以當RNA被釋放出來的時候，它的polyA尾巴剛好和凝膠微珠上的poly(dT)VN序列結合，一個RNA連接到凝膠微珠上的一個序列。
當拿到帶有RNA的凝膠微珠之后，就可以在反轉錄酶的作用下生成cDNA，然后就是cDNA的擴增，就和Bulk RNA-seq里的擴增一樣了。
剛才我們看到擴增之后大致形成了如上圖所示的序列，那這些序列都是什么呢？其中兩端藍色和黃色的P5和P7，是為了測序而加上的，它們更夠和測序芯片上的寡聚核苷酸鏈進行互補結合；黑色的部分，Read1和Read2是測序引物；中間灰色的橫線即要檢測的核酸序列；Sample Index是加進去的樣本ID，因為雖然建庫的時候是分開的，但是測序的時候是多個樣本一起的，所以加進去樣本ID以作區分；剩下的綠色部分10X Barcode和紅色部分UMI是關鍵部分。每個凝膠微珠上只攜帶一種10X Barcode序列，即一個凝膠微珠上所有序列的Barcode部分都是序列相同的，它的作用是標記細胞，即測序完成后如何區分哪些序列屬於一個細胞的呢，就是看它們的Barcode部分是不是一樣的；UMI的全稱是Unique Molecular Index，它的作用是為了對RNA的絕對表達水平進行計數。細胞破裂后一個RNA分子會和凝膠微珠上的一個短核酸序列相結合，所以當我們比對確定RNA屬於哪個基因后，只需要把來自相同基因的RNA聚到一起，統計一下UMI的種類數就行了。注意，這里是UMI的種類數，不是UMI的個數。以下圖為例：
以這個圖為例，我們把相同基因對應的序列放在一起，我們可以看到它們都帶有一樣的綠色的部分，那個部分就是10X Barcode部分，這些序列來着同一個細胞，所以它們具有相同的Barcode。挨着Barcode往右一點就是UMI部分，可以看到Gene1有兩種UMI，每種兩個；Gene2有3種UMI，第一種3個、第二種1個、第三種1個、Gene3000有1種UMI，有3個。因此我們就可以知道，Gene1表達量為2，Gene2表達量為3，Gene3表達量為1，即它們的UMI去重后的個數。也可以看出雖然它們處在相同的擴增環境下，但是它們的擴增倍數並不相同，這個就是PCR擴增的偏好性。因為單細胞測序計算的是UMI的種類數，所以它避免了擴增偏好性的問題。以上就是10X Genomics單細胞測序的原理。
BD單細胞測序的擴增和測序部分和10X是一樣的，它們的區別主要在於捕獲單細胞的部分。
如上圖所示，這是BD捕獲單細胞的方法。首先它使用的不是雙十字系統，而是蜂巢板，一個一個孔，好像蜂巢一樣。每個孔的大小比一個細胞稍微大一些，可以同時放下一個細胞和一個凝膠微珠。它的操作是首先把細胞懸液倒在蜂巢板上，靜置，使細胞在重力作用下進入蜂巢孔（所以它的單細胞捕獲要比10X的慢），然后在蜂巢板上加上凝膠微珠，等凝膠微珠也落到蜂巢孔里和細胞結合，然后洗去多余的凝膠微珠，從而達到單細胞捕獲的目的。
但是這樣的操作會不會有的蜂巢孔是空的，而有的進去兩個細胞呢？當然是會的，想要每個孔里剛好都有一個凝膠微珠和一個細胞是很難的，但是只要這部分的比例不用太大就行。所以在它的儀器上會有如下的統計展示。在這個展示里會統計單細胞捕獲的具體情況，當右側這些統計的指標都是PASS的時候，就說明此次單細胞捕獲是合格的，可以進行后續的操作了。當細胞捕獲后，它的后續部分原理和10X就一樣了。
下圖是10X和BD的一個對比。
