單細胞RNA測序技術之入門指南
【字體： 大 中 小 】 時間：2018年09月12日 來源：生物通
在這個飛速發展的測序時代，DNA和RNA測序已經逐漸成為“實驗室中的家常菜”。若要評選出目前最受歡迎的一道菜，那恐怕非單細胞RNA測序莫屬。
以往，研究人員通常利用RNA測序（RNA-seq）來檢測樣本中的所有RNA轉錄本，以發現新型RNA，或開展基因表達分析。不過，測序的對象往往是組織樣本或細胞群，這使得細胞之間的差異有可能被平均值所掩蓋。
作為獨一無二的個體，細胞寶寶也許並不樂意自己的光芒被掩蓋。於是，單細胞測序應運而生。自2013年被《Nature Methods》評為年度技術以來，這項技術正被迅速地采用，發表文獻的數量也在逐年遞增。
單細胞RNA-seq能夠獨立地提供每個細胞的RNA表達譜，並鑒定異質細胞群中的稀有細胞。盡管腫瘤異質性可歸因於累積突變，但即使是遺傳上相同的細胞在相同環境下也可能表現出基因和蛋白表達水平的差異，從而導致耐葯性的產生。單細胞RNA-seq就能夠發現這些稀有個體。
單細胞RNA-seq的流程
當然，單細胞RNA-seq的開展絕非易事，需要用到一系列尖端技術。大家首先要高效分離單細胞，然后進行RNA提取、逆轉錄、文庫制備和測序，最后再通過生物信息學軟件進行數據分析。其中，第一步 – 單細胞分離就相當棘手。
單細胞分離
從異質性的細胞群體中分離單細胞，目前的選擇有不少，新方法也在不斷面世。選擇分離方法時，您可能需要考慮它是高通量還是低通量，以及是盲選還是有偏向的選擇（基於某個參數）。
一些高通量的技術，比如最常用的熒光激活細胞分選（FACS）和磁性激活細胞分選（MACS），可根據細胞的大小/形狀或細胞表面標志物的表達進行有偏向的選擇，而基於微流體和液滴的技術可實現細胞的無偏向分離，如Fluidigm C1和10x Genomics Chromium系統（微流體）以及Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator（液滴）。不過，需要注意的是，組織/細胞的解離過程可能會改變RNA的表達譜。
若對通量要求不高，可選擇在顯微鏡下手動挑選細胞，或采用激光捕獲顯微切割（LCM），這些是基於細胞形態或熒光報告基因表達的有偏向選擇，好處在於您可以了解單細胞所處的環境和它們以前的鄰居，缺點是您需要特別小心，以免切到細胞或細胞核。相比之下，細胞的有限稀釋就是無偏向的。
圖1. 細胞分離方法一覽
| 通量 |
技術 |
細胞選擇 |
細胞數量 |
終體積 |
| 高 |
FACS |
有偏向 |
幾百個 |
微升 |
| MACS |
有偏向 |
幾百個 |
微升 |
|
| 微流體 |
無偏向 |
幾百到幾千個 |
納升 |
|
| 液滴 |
無偏向 |
幾千個 |
納升 |
|
| 低 |
顯微操作 |
有偏向 |
幾十個 |
微升 |
| 有限稀釋 |
無偏向 |
幾十個 |
微升 |
RNA-Seq方案
標准的文庫制備方案適用於10-100 ng的DNA起始材料。然而，單個細胞平均只含有10 pg的總RNA。因此，RNA提取和文庫制備的流程必須經過調整和優化，才能用於單細胞材料。
首先，需要裂解分離出的單細胞，以獲得RNA。這個步驟可通過自動化設備完成，如上文提到的Fluidigm C1、10x Genomics Chromium和Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator，也可利用市售試劑盒來手動完成，如Thermo Scientific Single Cell Lysis Kit。當然，細胞裂解和RNA純化的操作可同時進行，只需選擇您中意的試劑盒。
然后，大多數方案是通過polyA選擇來富集mRNA，並利用經過修飾的oligo dT引物來進行逆轉錄。在逆轉錄的過程中，有些方案利用獨特分子標識符（UMI）對單分子進行標記，這些是隨機的六核苷酸，可以更精確地定量單細胞中mRNA分子的初始量。之后，通過體外轉錄或PCR擴增cDNA，然后將擴增好的cDNA文庫用於文庫制備和高通量測序。
PCR方法的優點在於能夠產生全長cDNA。不過，對於不同片段（如GC含量較高），PCR的效率可能不同，導致文庫的覆蓋度不均勻。另一方面，體外轉錄產生的文庫能夠避免PCR的序列偏向，但有些序列的轉錄效率低，導致序列drop-out或不完整。
許多方案采用的都是Nextera文庫制備，並在Illumina的測序平台上開展。Illumina的一整套測序產品組合都適用於單細胞測序，具體取決於實驗的類型和規模。例如，NovaSeq 6000支持大規模的研究，而NextSeq 500特別適合小型實驗室。
早在2009年，湯富酬教授等人開發出第一種單細胞轉錄組測序技術mRNA-Seq。之后，許多新穎的技術被開發出來，可以更快速、更低成本地提供更多信息。我們早前回顧了一些熱門的單細胞RNA-seq方法，包括SMART-seq & SMART-seq2、CEL-seq、Drop-seq和inDrop。同時，新方法還在不斷涌現。
2016年，Broad研究所的研究人員在《Science》上發表了一種稱為sNuc-Seq的單核RNA測序方法。這種新方法適用於大腦等復雜組織，避免分離過程影響RNA含量。它利用從細胞中提取出的單個細胞核作為起始材料，獲取基因表達譜。可惜，該方法的通量並不高，主要在96孔或384孔板上開展。
為了實現更大規模的研究，Broad研究所的團隊轉向了微流體。他們受Drop-Seq方法的啟發，將單細胞與帶有DNA條碼的微珠一起包裹在微滴中，以便大大加速實驗進程，同時降低成本。2017年，他們開發出DroNc-Seq方法，並發表在《Nature Methods》上，也引起廣泛關注。
數據分析
由於每個單細胞都是獨特的，不可能開展重復實驗並評估噪音。因此，必須采取一些質量控制手段，以確保數據的可靠性。專家建議，向每個細胞裂解液中加入已知序列和數量的合成mRNA，如外源RNA對照聯盟（ERCC）開發的加標RNA。這些RNA的讀數將提供樣本間差異的信息。
總的來說，單細胞水平的轉錄組分析可以揭示細胞群體中的細胞異質性，強調了個別細胞的與眾不同。此外，同時分析多種分子（如DNA、RNA和蛋白質）的方法也不斷被開發出來。這種更全面的單細胞組圖有望進一步加深我們對生物學過程的了解，對未來的科研及臨床研究大有裨益。（生物通 薄荷）