對於雙端比對的數據，生成的BAM文件中，R1端序列和R2端序列的標識符是一樣的，之前一直不知道如何根據bam文件區分哪條序列是R1端，哪條序列是R2端，昨天仔細研究了一下，原來代表R1端和R2端的信息都存儲在flag中，即bam文件的第二列；
在bam文件格式中定義了各種flag代表的意思
/*! @abstract the read is paired in sequencing, no matter whether it is mapped in a pair */ #define BAM_FPAIRED 1 /*! @abstract the read is mapped in a proper pair */ #define BAM_FPROPER_PAIR 2 /*! @abstract the read itself is unmapped; conflictive with BAM_FPROPER_PAIR */ #define BAM_FUNMAP 4 /*! @abstract the mate is unmapped */ #define BAM_FMUNMAP 8 /*! @abstract the read is mapped to the reverse strand */ #define BAM_FREVERSE 16 /*! @abstract the mate is mapped to the reverse strand */ #define BAM_FMREVERSE 32 /*! @abstract this is read1 */ #define BAM_FREAD1 64 /*! @abstract this is read2 */ #define BAM_FREAD2 128 /*! @abstract not primary alignment */ #define BAM_FSECONDARY 256 /*! @abstract QC failure */ #define BAM_FQCFAIL 512 /*! @abstract optical or PCR duplicate */ #define BAM_FDUP 1024 /*! @abstract supplementary alignment */ #define BAM_FSUPPLEMENTARY 2048
1 ： 代表這個序列采用的是PE雙端測序
2： 代表這個序列和參考序列完全匹配，沒有插入缺失
4： 代表這個序列沒有mapping到參考序列上
8： 代表這個序列的另一端序列沒有比對到參考序列上，比如這條序列是R1,它對應的R2端序列沒有比對到參考序列上
16：代表這個序列比對到參考序列的負鏈上
32 ：代表這個序列對應的另一端序列比對到參考序列的負鏈上
64 ： 代表這個序列是R1端序列， read1;
128 : 代表這個序列是R2端序列，read2；
256： 代表這個序列不是主要的比對，一條序列可能比對到參考序列的多個位置，只有一個是首要的比對位置，其他都是次要的
512： 代表這個序列在QC時失敗了，被過濾不掉了（# 這個標簽不常用）
1024: 代表這個序列是PCR重復序列（#這個標簽不常用）
2048: 代表這個序列是補充的比對（#這個標簽具體什么意思，沒搞清楚，但是不常用）
上面的這幾個標簽都是2的n次方，這樣的數列有一個特點，就是隨機挑選其中的幾個，它們的和是唯一的，比如
65 只能是1 和 64 組成，代表這個序列是雙端測序，而且是read1
所以在bam文件中的第二列，即flag列的值代表這條序列符合上述所有條件的值的和，所以根據這個flag我們可以確定這條序列究竟是read1 還是read2
在新版的samtools中提供了一個flags 功能，可以查看flag 代表的含義，比如下面的sam文件
NB500986:26:HGJ2VBGXX:3:13403:17250:17986 419 chr1 12013 1 131M = 12016 131 TCTGACTTCCAGCAACTGCTGGCCTGTGCCAGGGTGCAAGCTGAG CACTGGAGTGGAGTTTTCCTGTGGAGAGGAGCCATGCCTAGAGTGGGATGGGCCATTGTTCATCTTCTGGCCCCTGTTGTCTGCAT AAAAAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEEEEEAEEEEAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE/EE/EE<EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE AS:i:0 XN:i:0 XM:i:0 XO:i:0 XG:i:0 NM:i:0 MD:Z:131 YT:Z:UU XS:A:+ NH:i:4 CC:Z: chr15 CP:i:102519027 HI:i:0 NB500986:26:HGJ2VBGXX:3:13403:17250:17986 339 chr1 12016 1 128M = 12013 -131 GACTTCCAGCAACTGCTGGCCTGTGCCAGGGTGCAAGCTGAGCAC TGGAGTGGAGTTTTCCTGTGGAGAGGAGCCATGCCTAGAGTGGGATGGGCCATTGTTCATCTTCTGGCCCCTGTTGTCTGCAT EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEE<AEEEEEEEEEEEAEEEAEEEEEEEEEEEAEEEEE EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAAEEAEEEEEAEEEEEEEEEE/EEEEEEEEEEEAAAAA AS:i:0 XN:i:0 XM:i:0 XO:i:0 XG:i:0 NM:i:0 MD:Z:128 YT:Z:UU XS:A:+ NH:i:4 CC:Z: chr15 CP:i:102519027 HI:i:0
一共有兩個序列，他們的標識符是一樣的，那怎么區分那個是R1端，那個是R2端呢？
直接根據flag 查看
samtools flags 419 0x1a3 419 PAIRED,PROPER_PAIR,MREVERSE,READ2,SECONDARY samtools flags 339 0x153 339 PAIRED,PROPER_PAIR,REVERSE,READ1,SECONDARY
根據上面給結果可以看出，flag為419代表PAIREED(1), PROPER_PAIR(2),MREVRSE(32),READ2(128),SECONDARY(256)，其中
PAIRED 代表這條序列采用雙端測序， 其值為1；
PROPER_PAIR 代表這條序列完全匹配， 其值為2；
MREVRSE 代表這條序列對應的另一端序列比對到參考序列的負鏈上，其值為32；
READ2 代表這條序列是R2端序列，其值為128
SECONDARY 代表這條序列不是primary alignment, 其值為256
1 + 2 +32 +128 + 256 = 419
所以419對應的序列是R2端序列， 同理，339代表的序列是R1段序列
搞清楚了序列究竟是R1端還是R2端之后，還有一點值得注意的地方，samtools 還提供了一個bam2fq 的功能，根據bam文件抽取比對時采用的fastq序列
在bam文件中，第10列代表的是序列，第11列代表的是序列的質量，根據第二列的flag還可以確定序列是R1還是R2,
但是當序列本身比對到參考序列的負鏈時，即flag 包含16時，bam文件中記錄的序列是原始序列的反向互補序列，而且質量值也是反向的，所以根據這樣的序列還原時要小心一點，以上面flag為339的序列為例
因為339包含了REVERSE,所以對應的序列應該是第10列序列的反向互補序列，鹼基質量值為第11列的反向序列，
搞清楚了這些，對於bam文件的理解又更清晰了一些。