源自：http://sanwen.net/a/hirxmpo.html
samtools是一系列處理bam和sam格式文件的應用程序集合，具有眾多的功能。
首先呢，bam和sam文件主要是bwa、bowtie、tophat等序列比對工具產生的，這些軟件我們后面會談到。
軟件下載安裝：
地址：https://sourceforge.net/projects/samtools/
解壓下載后的壓縮文件，然后你會看到README文件，里面有詳細的安裝操作說明。
安裝成功后，運行samtools，你會看到：
目前最新版本是1.3.1
下面我們針對samtools的主要命令以及參數做個實例演示。
操作文件下載：
wget http://popgen.dk/software/download/angsd/bams.tar.gz
解壓后，在bams文件夾下，你會看到10個bam文件：
名字太復雜，進行批量重命名
rename "s/.mapped.ILLUMINA.bwa.CEU.low_coverage.20111****14.bam//" *
結果如下：
1、view
主要功能：sam和bam文件之間相互轉換，針對bam文件進行相關操作。bam文件是sam文件的二進制格式，占據內存較小且運算速度快。
查看view的主要參數：
重要參數釋義：
-b：輸出bam格式，用於后續分析
-C：輸出CRAM文件
-1：快速壓縮（需要-b）
-u：輸出未壓縮的bam文件，節約時間，占據較多磁盤空間（需要-b）
-h：默認輸出sam文件不帶表頭，該參數設定后輸出帶表頭信息
-H：僅僅輸出表頭信息
-c：僅打印匹配數
-o：輸出文件（stdout標准輸出）
-U：輸出沒有經過過濾選擇的reads
-t：制表分隔符文件（需要提供額外的參考數據，比如參考基因組的索引）
-L：僅包括和bed文件有重疊的reads
-r：僅輸出在STR讀段組中的reads
-R：僅輸出特定reads
-q：定位的質量大於INT[默認0]
-l：僅輸出在STR 庫中的reads
-F：獲得比對上（mapped）的過濾設置[默認0]
-f：獲得未必對上（unmapped）的過濾設置[默認0]
-T：使用fasta格式的參考序列
……
實例演示：
bam文件轉換為sam文件
samtools view -h smallNA06985 > test.sam
sam文件轉換為bam文件
samtools view -bS -1 test.sam > test.bam
提取比對到參考基因組上的數據
samtools view -bF 4 test.bam > test.F.bam
提取沒有比對到參考基因組上的數據
samtools view -bf 4 test.bam > test.f.bam
雙端reads都比對到參考基因組上的數據
samtools view -bF 12 test.bam > test.12.bam
單端reads1比對到參考基因組上的數據
samtools view -bF 4 -f 8 test .bam > test1.bam
單端reads2比對到參考基因組上的數據
samtools view -bF 8 -f 4 test.bam > test2.bam
2、sort
主要功能：對bam文件進行排序（不能對sam文件進行排序）
主要參數釋義：
-l：設置文件壓縮等級，0不壓縮，9壓縮最高
-m：每個線程運行內存大小（可使用K M G表示）
-n：按照read名稱進行排序
-o：排序后的輸出文件
-T：PREFIX臨時文件前綴
-@：設置排序和壓縮的線程數，默認單線程
用法：
samtools sort -l 9 -m 90M -n -o test.sort.bam -T sorted -@ 2 test.bam
上述含義是：壓縮最高級9、每一個線程內存90Mb、輸出文件名test.sort.bam、臨時文件前綴sorted、線程數2。
當然，最簡單命令：
samtools sort test.bam -o test.sort.bam
3、index
主要功能：對bam文件建立索引，但在此之前必須進行排序（sort），生成后綴是.bai的文件。
參數釋義：
-b：創建一個.bai格式的索引文件（默認）
-c：創建.csi格式的索引文件
-m：創建.csi文件，索引的最小間隔值
用法：
samtools index test.sort.bam
4、merge
功能：合並多個已經sort的bam文件
當有多個樣本的bam文件時，可以使用samtools的merge命令將這些bam文件合並為一個排序的且保持所有輸入記錄並保持現有排序順序的bam文件。
主要參數釋義：
-n：輸入根據read排序的文件
-r：RG標簽添加到每個比對文件上，標簽值來自文件名
-u：輸出未壓縮的bam文件
-f：覆蓋同名文件
-1：壓縮等級1
-l：壓縮等級0-9
-R：合並輸入文件的指定區域
-h：FILE 指定FILE內的’@’頭復制到輸出bam文件中並替換輸出文件的文件頭
-c：多個輸入文件包含相同的@RG頭ID時，只保留第一個到合並后輸出的文件
-p：合並的每一個文件中的@PG ID只保留第一個文件中的@PG
-s：覆蓋隨機種子
-b：文件列表，一行一個
用法：
samtools merge merge.bam smallNA06985.sort smallNA06994.sort
5、faidx
功能：對fasta格式的文件建立索引，后綴名.fai。根據索引文件和序列文件，可以快速提取任意區域的序列文件。
fasta序列格式要求：每條序列，除了最后一行外，其他行的長度必須相同！
為了方便，我們在NCBI上下載水稻NIP基因組的序列，進行演示：
地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=rice
然后，進行解壓縮，重命名為seuence.fa
用法：
samtools faidx sequence.fa
最后生成一個sequence.fa.fai索引文件，一共5列，每列之間tab分割。
第一列：序列的名稱
第二列：序列長度
第三列：第一個鹼基的偏移量，從0開始計數
第四列：除了最后一行外，序列中每行的鹼基數
第五列：除了最后一行外，序列中每行的長度（包括換行符）
從中呢，我們可以有目的的提取序列：
提取水稻第一染色體：
samtools faidx sequence.fa Chr1 > Chr1.fa
提取水稻第一染色體100-200bp的序列：
samtools faidx sequence.fa Chr1:100-200 > Chr1_100_200.fa
6、tview
作用：直觀顯示reads比對到基因組的情況，和基因組瀏覽器有點類似。
-d：輸出類型
-p：直接定位給定位置
-s：reads顯示
當給出參考基因組的時候，會在第一排給出參考基因組的序列，否則第一排全用N表示。
首先利用sort進行排序后，在利用index建立索引后，用下面命令：
samtools tview test.sort.bam
具體操作：按下g鍵，如上界面，有一個Goto對話框，提示輸入要到達基因組的某一個位點。在這里，由於沒有提供參考基因組，第一排都是N。
我們可以使用H（左）J（上）K（下）L（右）移動顯示界面。大寫字母移動快，小寫字母移動慢。使用空格鍵向左快速移動，CTRL+H向左移動1KB，CTRL+L向右移動1KB。
此外，可以利用顏色來標注比對質量、鹼基質量、核苷酸等。
>=30的鹼基質量或比對質量使用白色表示
20-39的用黃色表示
10-19的用綠色表示
0-9的用藍色表示
使用字母r切換顯示read name等。
具體的操作說明可以？鍵查看。
7、flagstat
作用：reads的比對情況統計
Usage: samtools flagstat [--input-fmt-option OPT=VAL] <in.bam>
用法：
samtools flagstat test.sort.bam
解釋：
#總的reads
45456 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
0 + 0 secondary
0 + 0 supplementary
321 + 0 duplicates
#總體reads比對率
45293 + 0 mapped (99.64% : N/A)
#PEreads
45327 + 0 paired in sequencing
#read1
22670 + 0 read1
#read2
22657 + 0 read2
#PE reads比對到同一條參考序列，並且兩條reads之間的距離符合設置的閾值
44950 + 0 properly paired (99.17% : N/A)
#PE中兩條都比對到參考序列上的reads數
45001 + 0 with itself and mate mapped
#單獨一條匹配到參考序列上的reads數，和上一個相加，則是總的匹配上的reads數。
163 + 0 singletons (0.36% : N/A)
#PE中兩條分別比對到兩條不同的參考序列的reads數
23 + 0 with mate mapped to a different chr
#PE中兩條分別比對到兩條不同的參考序列的reads數（比對質量>=5）
11 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
8、depth
作用：每個鹼基位點的測序深度
-a：輸出所有的鹼基深度（包括0）
-b/-r：控制深度的范圍（后面跟染色體）
-f：bam文件名字
-l：設置read長度閾值
-d/-m：最大覆蓋深度
-q：鹼基質量閾值
-Q：比對質量閾值
samtools depth -a -r 3 test.sort.bam
結果是tab分割的三列
第一列：染色體名稱
第二列：鹼基位置
第三列：測序深度
9、mpileup
作用：對參考基因組每個位點做鹼基堆積，用於call SNP和INDEL。主要是生成BCF、VCF文件或者pileup一個或多個bam文件。比對記錄以在@RG中的樣本名作為區分標識符。如果樣本標識符缺失，那么每一個輸入文件則視為一個樣本。
主要參數釋義：
-A：在檢測變異中，不忽略異常的reads對
-C：用於調節比對質量的系數，如果reads中含有過多的錯配，不能設置為零
-D：輸出每個樣本的reads深度
-l：BED文件或者包含區域位點的位置列表文件
注意：位置文件包含兩列，染色體和位置，從1開始計數。BED文件至少包含3列，染色體、起始和終止位置，開始端從0開始計數。
-r：在指定區域產生pileup，需已建立索引的bam文件，通常和-l參數一起使用
-o/g/v：輸出文件類型（標准格式文件或者VCF、BCF文件）
-t：設置FORMAT和INFO的列表內容，以逗號分割
-u：生成未壓縮的VCF和BCF文件
-I：跳過INDEL檢測
-m：候選INDEL的最小間隔的reads
-f：輸入有索引文件的fasta參考序列
-F ：含有間隔reads的最小片段
……
用法：
生成一個簡單的vcf文件
samtools mpileup -vu test.sort.bam
如果有參考基因組的話
samtools mpileup -vuf genome.fasta test.sort.bam
10、dict
作用：建立參考基因組字典
用法：
samtools dict test.sort.bam sequences.fa
11、cat
作用：連接多個bam文件（不做排序）
Usage: samtools cat [-h header.sam] [-o out.bam] <in1.bam> [...]
用法：
samtools cat -o out.bam smallNA06985 smallNA06994
12、split
作用：根據read group 分割bam文件
用法：
samtools split test.sort.bam
13、quickcheck
作用：檢查SAM/BAM/CRAM文件的完整性
用法：
samtools quickcheck -v *.bam > bad_bams
14、fastq
作用：bam文件轉換為fastq
用法：
samtools fastq test.bam
15、fasta
作用：bam文件轉換為fasta
用法：
samtools fasta test.bam
16、idxstats
作用：檢索和打印與輸入文件相對應的index file里的統計信息
Usage: samtools idxstats <in.bam>
用法：
samtools idxstats test.sort.bam
結果返回一個表格，4列。
第一列：序列名
第二列：序列長度
第三列：比對上的reads數
第四列：未必對數目
17、stats
作用：對bam文件做詳細統計,其統計結果可用mics/plot-bamstats作圖
用法：
samtools stats test.bam
輸出的信息比較多，部分如下：
Summary Numbers，raw total sequences，filtered sequences, reads mapped, reads mapped and paired,reads properly paired等信息
Fragment Qualitites：根據cycle統計每個位點上的鹼基質量分布
Coverage distribution：深度為1，2，3，，，的鹼基數目
ACGT content per cycle：ACGT在每個cycle中的比例
Insert sizes：插入長度的統計
Read lengths：read的長度分布
18、reheader
作用：替換bam文件的頭
用法：
samtools view -H test.bam > in.header.bam
samtools reheader -p -i in.header.bam test.bam
19、rmdup
作用：將由PCR duplicates 獲得的reads去掉，並保留高比對質量的reads
用法：
samtools rmdup -sS test.bam output.bam
20、phase
作用：call雜合SNP，確定相位
用法：
samtools phase test.bam
21、calmad
作用：計算MD tag（a optional field，記錄了mismatch信息）
用法：
samtools calmd test.bam sequences.fa