經典：基因組測序數據從頭拼接或組裝算法的原理

 

基因組測序數據的拼接/組裝 （圖片來源：google）  

 

每一個物種的參考基因組序列（reference genome）的產生都要先通過測序的方法，獲得基因組的測序讀段（reads），然后再進行從頭拼接或組裝（英文名稱為do novo genome assembly），最后還原測序物種的各條染色體的序列，即ATGC四種鹼基的排列順序。

 

之所以要進行基因組拼接，是因為現在的測序技術還只能測較短的序列，無法直接獲取一整條染色體的序列。如一代測序（Sanger測序）一般可測1kb左右的序列；二代測序（next-generation sequencing），一般可測50~500bp；三代測序雖然可測100kb甚至更長的序列，但現在三代測序技術還不是很成熟，還有較高的測序錯誤率。（歡迎關注微信公眾號：AIPuFuBio，和使用生物信息學平台AIPuFu：www.aipufu.com）

 

基因組測序數據的從頭組裝過程，可簡單描述為：reads---->contig---->scaffold---->chromosome，具體如下所示：

基因組序列從頭組裝示意圖（圖片來源：Guo et al. Genomics, 2017）。

 

首先基因組測序產生reads，然后對reads進行組裝產生長片段Contigs，再確定Contig的方向和順序，組裝產生更長的片段Scaffolds，最后再組裝連接Scaffold得到完整的染色體序列。

 

接下來，給大家依次介紹一下上圖從頭拼接中涉及到的兩個概念：contig和scaffold。

Contig是由多個reads通過組裝而形成的長片段。由於測序讀段較短、基因組序列通常含有較多重復序列、而且還有測序錯誤等原因，除了簡單的基因組序列外，大部分物種的基因組序列組裝都會先產生很多contig，無法一次獲得完整的染色體序列。

Scaffold為多條contig序列連接形成更長片段，這些contig方向和順序已經確定，且contig間未知序列（一般用NNNN表示）的長度也獲知。

 

Scaffold的獲得一般主要通過雙端測序（如paired-end sequecing或mate-pair sequencing）來確定contig的順序和方向，以及contig之間的間隔距離，具體如下示意圖所示。

由reads組裝產生contig，再由contig連接形成scaffold的示意圖 （圖片來源：google）  

 

基因組測序數據的從頭組裝的核心算法主要可以分為以下幾大類：

1、基於貪心算法（greedy-extention）；

2、基於Overlap-Layout-Consensus（OLC）；

3、基於de Bruijn Graph；

4、以上兩種或多種算法的組合；

5、其他類型。

 

具體如下圖所示：

基因組從頭組裝算法分類及代表性軟件發表的時間（圖片來源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

其中最經典的兩類為：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法，基於OLC算法的組裝軟件主要是針對長測序讀段（如Sanger測序、454測序等）設計的；

2）de Bruijn Graph算法，基於de Bruijn Graph的組裝軟件則主要是針對二代測序產生的短讀段數據設計。

 

具體如下所示：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法

Overlap-Layout-Consensus（OLC）算法的示意圖（圖片來源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

 

2）de Bruijn Graph算法

de Bruijn Graph算法的示意圖（圖片來源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

 

現在主流的是二代測序技術，因此再給大家詳細介紹一下專門針對二代測序數據開發的基於de Bruijn Graph的從頭拼接方法。

 

其中一個非常著名的軟件就是Velvet，是基於de Bruijn Graph設計的經典代表，其算法示意圖如下：

Velvet從頭組裝軟件的算法設計示意圖（ 圖片來源：Zerbinoet al. 2008, Genome Research）。其中紅色鹼基為測序錯誤或SNP位點。

 

Velvet的組裝原理，主要可分為這幾個步驟：

1）首先把所有測序讀段（reads）都分割為更小的片段k-mer；

Reads產生k-mer的過程示意圖。這里k為7，假如read的長度為n，則總共可產生n-1個k-mer。

2）把每個k-mer作為一個節點，然后判斷k-mer之間是否有k-1鹼基的重疊，如果有則作為兩個不同的節點連接起來。依次這樣連接所有可連接的k-mer就形成了Velvet從頭組裝軟件算法設計示意圖中第2步的de Bruijn Graph；

3）依次合並相鄰的k-mer，因為相鄰的k-mer有k-1個鹼基的重疊，就可進一步簡化de Bruijn Graph形成Velvet從頭組裝軟件算法設計示意圖中第3步的簡化后的圖；

4）使用一系列算法消除由測序錯誤而形成的tips（具體如Velvet從頭組裝軟件的算法設計示意圖中所示），並合並bubbles（兩條或多條路徑序列，一般由SNP造成，如Velvet從頭組裝軟件的算法設計示意圖）；

5）最后拼接得到Contig序列。

 

值得注意的是，Velvet從頭組裝軟件算法設計示意圖中最后一步拼接產生了回文序列，主要是由於原始序列中含有回文，如果k取為偶數（圖中k=4）就容易在組裝中形成這種現象。

為了有效的避免拼接中產生回文序列，一般k取為奇數。

 

那么基於基因組測序數據的從頭拼接軟件，那些具有較好的性能呢？

不同從頭組裝軟件在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox基因組時的准確性和覆蓋度比較（ 圖片來源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

 

從上圖中可以看出，Velvet和SOAPdenovo在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox的基因組序列時，相對於其他軟件，組裝結果更准確（A：Percentage of correctly mapped contigs）且拼接出來的序列能更完整的覆蓋原基因組序列（B：Genome Coverage）。

 

大部分處理測序數據的軟件都是由國外開發的，其中這里提到的SOAPdenovo為華大基因開發的從頭拼接軟件。

 

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