一：利用pilon軟件進行二代數據對三代數據polish

 

准備數據 ：

1. 三代數據組裝好的基因組文件：draft.fa
2. illumina的雙端測序數據經過質控之后的數據：read1_fq.gz read2_fq.gz

 

比對（bwa）

 

構建索引

 

$bwa index -p index/draft draft.fa

　　

• 比對並排序

• $bwa mem -t 16 index/draft raed1_fq.gz read2_fq.gz |samtools sort -@ 10 -O bam -o align.bam

 

• 對比對好的bam文件建索引

• $samtools index -@ 10 align.bam
  

   

• 標記重復　

$sambamba markup -t 10 align.bam align_markup.bam

　

過濾高質量比對的reads

$samtools view -@ 10 -q 30 align_markup.bam >align_filter.bam
$samtools index -@ 10 align_filter.bam

 

使用pilon進行polish　

java -Xmx10G -jar pilon-1.23.jar --genome draft.fa --frags align_filter.bam --fix snp,indels --output pilon_polished --vcf & >pilon.log

　　

• pilon的參數
• --frags: 表示輸入的是1kb以內的paired-end文庫，
• --jumps表示 大於1k以上的mate pair文庫,
• --bam則是讓軟件自己猜測
• -vcf: 輸出一個vcf文件，包含每個鹼基的信息
• --fix: Pilon將會處理的內容，基本上選snps和indels就夠了
• --variant: 啟發式的變異檢測，等價於--vcf
• --fix all,breaks, 如果是polish不要使用該選項
• --minmq: 用於Pilon堆疊的read最低比對質量，默認是0。

二：可用 samtools, arrow, pbmm2, pbindex 用三代Pacbio組裝后的結果 進行polish

准備數據

• 組裝得到的基因組文件raw_assembly.fa [falcon, canu, mecat2 以及flye等軟件只對三代數據進行組裝得到的組裝結果
• 公司給的raw bam文件【類似這樣的XXX.subreads.bam】

由於GenomicConsensus只能在Python上運行，所以已經被gcpp取代了，因此最后一步arrow也可以用gcpp運行：
gcpp用法與GenomicConsensus類似，參數都類似，所以最后一步可以改為：

$gcpp -j 16 -r assembly.fa -o variants.vcf -o consensus.fasta map.pacbio.bam

　　

三. 最后使用quickmerge對多個軟件拼接的結果進行合並，來提高組裝質量

 

最簡單的就是直接運行quickmerge的一個py腳本

$merge_wrapper.py hybrid_assembly.fasta self_assembly.fasta

　　

還有一種是分步運行

$nucmer -l 100 -p out1 -t 8 reference.fa query.fa
$delta-filter -i 95 -r -q out.delta > out.rq.delta
$quickmerge -d out.rq.delta -q query.fa -r reference.fa -hco 5.0 -c 1.5 -l 520000 -ml 10000

　

一般-l選擇引用(-r)程序集的N50作為初始值，-ml一般大於5000。

這里講一下nucmer和delta-filter都是mumer里面的程序包，quickmerge里面自帶了mummer,要是想進一步了解也可以自己下載：mummer官網github的mummer

 

• nucmer參數及用法

  $nucmer  [options]  <Reference>  <Query>
  
  -l|minmatch       設置單個匹配的最小長度(默認20)
  -p|prefix         設置輸出文件的前綴(默認為out)　　

 

• delta-filter參數及用法

• $delta-filter  [options]  <deltafile>
  
  -i float         設置最小對齊標識[0,100]，默認為0
  -r               允許query overlaps（多對多）
  -q               允許reference overlaps（多對多）
  

  　　

1 可以 merge 兩種不同組裝方法的三代組裝結果 (e.g. one generated with PBcRor canu and another generated with FALCON).

2 You can run Ka-kit's finisherSC after running quickmerge to improve the contiguity even further.

3 組裝merge前后的Assembly polishing with Quiver and pilon is strongly recommended.

 

 

來源：

https://www.jianshu.com/p/b5b420d1eb17

https://github.com/mahulchak/quickmerge/wiki

對組裝之后的三代基因組進行polish