SNP(單核苷酸多態性)准確性的驗證,你造嗎?


SNP(單核苷酸多態性)准確性的驗證,你造嗎?

【2016-12-12】
 
 
 

SNP(全稱Single Nucleotide Polymorphisms)即單核苷酸多態性,主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性,包括單個鹼基的轉換、顛換等。SNP定位分類:可分為基因編碼區、基因周邊以及基因間SNP等三類;SNP位置區域包括UTR區、編碼區的外顯子或內含子區 、可變剪切位點等等。

SNP是人類可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上,所以SNP的應用范圍較微衛星標記更加廣泛,在群體遺傳學、生態環境學、制葯業、法醫學、癌症及遺傳性疾病甚至進化方面的研究都有不同程度的應用。研究人員希望通過SNP的研究,更深刻地認識癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等多基因疾病的發生機制,主要應用有:

1、確定基因多態性和疾病的關系   

2、解釋個體間的表型差異對疾病的易感程度 

3、對未來疾病做出診斷 

4、研究不同基因型個體對葯物反應的差異,指導葯物開發及臨床合理用葯 

5、個體間SNP千差萬別,通過SNP檢測等技術進行法醫鑒定及個體識別

 

SNP的研究前期通常基於下一代測序(NGS)技術對大量樣本進行全基因組測序,通過與參考序列的比對發現並構建SNP數據庫,之后對數據庫中大量的SNP進行驗證,並經過統計學分析找到少量與疾病或性狀關聯的SNPs。目前對SNP進行驗證檢測的方法主要有:

 

1、 擴增測序

    原理:Sanger測序

    特點:方法穩定,可靠,通量低,成本高

 

 

2、SNaPshot 檢測

    原理:基於熒光標記單鹼基延伸原理的分型技術,也稱小測序。在體系中加入測序酶,四種熒光標記的ddNTP,緊挨多態位點5,端的延伸引物和PCR產物模板,PCR擴增過程中,引物延伸一個鹼基即終止,經ABI測序儀電泳后,根據峰的顏色可知摻入的鹼基種類,從而確定該樣本的基因型,根據峰移動的位置確定該延伸產物對應的SNP位點。


    特點:

a)采用多重單鹼基檢測技術,每次可以檢測10~20個位點,通量高,速度快;

b)同時檢測基因組任何位置上的SNP位點,且數據完整性高;

c)基於3730xl測序儀平台的檢測技術,直接得到位點的鹼基組成,檢測結果直觀、穩定、可靠;

d)價格比較低廉。

 

3、Mass Array

    原理:該技術基於Sequenom質譜儀平台,通過PCR擴增出含有SNP位點的一段DNA(SNP位點前后各50bp左右),用SAP酶去除掉PCR 體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP),加入一單鹼基延伸引物,其3’末端鹼基緊挨SNP位點,采用四種ddNTP替代dNTP,這樣,探針在SNP位點處僅延伸一個鹼基,連接上的ddNTP與SNP位點的等位基因對應,樹脂交換,純化延伸后產物,用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)檢測延伸產物與未延伸引物間的分子量差異,確定該點處鹼基。

 

    特點:

a) 一次可以檢測20-40個位點;通量高,一次可以檢測384個樣本;

b) 1管式操作,避免換管,降低被污染的概率;

c)檢測靈敏,可檢測pmol級別的物質;

d)適合大量樣本檢測,但是有一些SNP位點不適合設計延伸引物,無法檢測,且缺失的數據難以補充。

 

 

4、Taqman探針法

    原理:該技術基於實時熒光定量平台,每個SNP位點設計一對Taqman探針,分別標記不同的熒光。5’末端攜有報告熒光基團,3’端標有熒光淬滅基團,Taq聚合酶具有外切活性,從而將探針5 ’端連接的熒光分子從探針上切割下來,破壞兩熒光分子間的PRET,發出熒光。


    特點:
a)操作簡單、檢測速度快、靈敏度高;
b)一次一般檢測1個位點,兩個SNP位點之間太近或者SNP序列附近有特殊結構,不易設計探針;
c)少量樣本檢測費用高,適合位點少,樣本量大的情況。

 

 

除了上述幾種方法,還有焦磷酸測序、HRM(高分辨率溶解曲線分析技術)、Microarray芯片法、MALDI-Tof、dHPLC(變性高效液相色譜技術)、RFLP、SSCP、DGGE等。

 

閱微基因在SNP檢測方面有豐富的經驗,開展多種不同的檢測方法,可根據客戶的樣本和位點的數量選擇最合適的實驗方法。每個項目的檢出率不低於95%。針對有特殊結果的位點,我們會采用高效的DNA聚合酶,確保每個位點都有實驗結果,進一步確保了客戶數據的完整性。另外,閱微基因可以針對口腔拭子,唾液等樣本提取DNA進行SNP檢測分析。在此基礎上提供基因分型分析、關聯分析、聚類分析、遺傳圖譜等服務,使客戶的研究更順利。


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