微生物+計算細胞倍增時間

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## 1 簡介 雖然做生長曲線和求代際時間貌似是個很簡單常規的東西，可是到我一直不大確定自己求的對不對... 這次下定決心不再亂做... 不看解釋，跳到[作圖](#tag)
## 2 定義 ### 微生物 * 細菌，真菌

培養和測定

• 細菌：液體培養，不同的時間測定OD₆₀₀的吸光度。固體培養稀釋塗布測定colony forming unit（CFU）數量。
• 真菌：平皿固體培養，不同時間測定半徑。

對 細菌 來說每個細胞都有分裂能力，但是真菌只有尖端的細胞在進行分裂，后面的細胞在增長（Chang）。

描述生長的一些度量

• 瞬時生長速度（growth rate）：

  • 細菌：在單位時間里測量值得變化。
  • 真菌：徑向生長速度：radial growth rate K_r，有的時候叫colony radial growth rate。
  • 單位：測量單位/單位單位，比如CFU/h，μm/h。
  • 生長速度與生長條件，初始濃度等有關系。

• 單位生長率（specific growth rate），μ 表示。

  • 描述的是在指數生長期的生長能力。
  • 單位是 時間-1，可以是任何時間單位，通常用 h-1。

• 相對生長速度（relative growth rate） 相對當前生物量的生長速度，如果大小為一個常數，則用 k 表示。

  • 因為在德語里面常量是 konstant 所以縮寫成 k，有的時候又用的 C 表示常量，嗯，是 constant。
  • 單位也是 時間-1。
  • 注意 k 和 μ 不一樣。

• 細胞倍增時間（doubling time）：t_d，也稱為代際時間，代時（generation time）：g。

  • \(g=1/μ\)
  • \(g=ln2/k\)

從這里也能看出 μ 和 k有個倍數差距。后面公式推導再說明。

說明

• 細菌測定是OD不是細胞數量，如果要知道絕對數量需要測定OD和CFU之間的關系。
• 不管原始數據是什么，其形式都是X：t1到t2的時間點 ，Y:生長狀態的度量。
• Y軸取對數，指數生長期為一條直線。這是判斷指數生長的標准。
• 【重點】生長速度 描述的是一種狀態，而 k 和 μ 是一種能力，他們之間沒有特定的轉換關系，但是你能計算出當微生物以 k 能力生長的時候，它的 生長速度 是多少。

## 3 公式推導 然后為啥我一直搞不太清楚，是因為微積分全部忘記了。最近在二手市場買了同濟的高數，當時擺攤的小哥祝我考研順利，嗯，如果一切可以重來...說遠了

什么是分裂

情況1

• 從時間（t）角度來看
  • 分裂是一個1變2，2變4的過程，如果 每1秒鍾 細胞發生一次分裂，t時間 之后，從 1個 細胞能夠增加到 2^t 這種量和時間的關系為指數關系。
    $$P(t)={P}_{o}{2}^{t}$$
    其中，
    P -- population size，種群大小。
    P_o -- 初始的種群大小。
    t -- 時間，常用單位小時 h。

情況2

• 從代際（generation）的角度來看：
  • 分裂是一個1變2，2變4的過程，如果 每1代 細胞發生一次分裂，n代 之后，從 1個 細胞能夠增加到 2^t 這種量和時間的關系為指數關系。
    $$P(n)={P}_{o}{2}^{n}$$
    其中，
    P -- population size，種群大小，理解為細胞個數。
    P_o -- 初始的細胞個數。
    n -- 細胞數量翻倍的代際數。
    g -- generation time，細胞倍增時間，常用單位小時 h。
    μ -- specific growth rate，定義 \(μ=1/g\)，單位 h^-1。

注意 μ 是人為定義的，因為分裂發生的實際間隔是代際的長度，而非平常的秒和小時，所以情景1其實是一個特例。

• 如何計算 g
  • 已知 P(t₂)/P(t₁) = 2， n = t/g。
  • 用t代替n，在t₂和t₁時間：
    $$P\left({t}_{1}\right)={P}_{o}{2}^{{t}_{1}g}$$
    $$P\left({t}_{2}\right)={P}_{o}{2}^{{t}_{2}g}$$
• 把P_o移到等式左邊，等式兩邊取10為底數的對數，然后兩個做減法，推導出。
  $$g={{t}_{2}-{t}_{1}}{}$$

也就是說，我們只是需要知道在指數增長范圍內，那兩個時間點數量發生了倍增。嗯，廢話。這不就是g的定義。不過這個就是作圖的原理。

k和μ的關系

• 上面對分裂的定義已經能算出 μ 和 g了，那 k 是啥？
  • 我理解的是，假設你不知道分裂可以用以2為底數的指數函數描述，而從分裂速度來描述分裂的過程，推導過程中定義的一個常數。

解釋k用到的基本概念

• W :一種生物量當前的的 度量，可以是重量，半徑，濁度。
• t :時間。
• 瞬時生長速度（growth rate）：\(dW/dt\)。

如果你忘了 d 是什么，就理解成很小。所以，以上表示在很短時間內，生物量的變化。

• 相對生長速度（relative growth rate）：
  $$\frac{1}{W}\frac{dW}{dt}$$
  • 為什么關心相對的速度？
  • 假設1個細胞，1秒之后變成了2個，這1秒內的生長速度（growth rate）是（2-1）個/1s=1個/s。
  • 假設4個細胞，1秒之后變成了8個，這1秒內的生長速度（growth rate）是（8-1）個/1s=7個/s。
  • 差的有點多，因為初始量不一樣，而我們關心的是生長的能力，不是初始量有什么不同，所以需要相對生長速度。

情況3

• 如果相對生長速度是一個常數 k，這就是細胞分裂的過程。
  $$\frac{1}{W}\frac{dW}{dt}=k$$

  • wiki里面寫的是不難推出這是一個指數函數。摔，憑啥？這不是小時候不會解題的慣用招數？

  • 在高數書的幫助下發現，的確不難推出，嚶嚶嚶。

  • 如果你和我一樣渣，可以看看下面不難推出的過程。

  • 等式兩邊積分
    $$\int \frac{dW}{W}=\int kdt$$

  • 書上說左邊不定積分結果是 \(ln|W|+C\)

  • 書上說右邊不定積分結果是 \(kt+C\)

  • 已知W>0，生物量變化這個階段量應該都是正的吧。
    $$lnW=kt$$
    $$W={e}^{kt}$$

嗯，真的是指數函數。

如何求 k ？

• 時間 t₁ 和 t₂ 之間定積分吧。
  $$\int_{{t}_{1}}^{{t}_{2}} \frac{dW}{W}=\int_{{t}_{1}}^{{t}_{2}} kdt$$
  $$ln({W}_{2}/{W}_{1})=k({t}_{2}-{t}_{1})$$
  $$k=\frac{ln{W}_{2}-ln{W}_{1}}{{t}_{2}-{t}_{1}}$$

• 如果知道了時間和相應的W，就能計算 k。通常計算用的10為底，將對數的底數從e換成10。
  $$k=\frac{{log}_{10}{W}_{2}-{log}_{10}{W}_{1}}{{t}_{2}-{t}_{1}\times {log}_{10}e}$$

• 計算倍增時間 g 或者t_d，倍增也就是 W₂ = 2W₁，t₂-t₁ = g，帶入到上面的方程。
  $$g=\frac{ln2}{k} $$

到這一步就能看出來，生長既可以用2為底數又可以用自然對數為底的指數函數描述，不一樣的函數計算的 g 都是一樣的。也應該一樣。但是用來描述函數的常數不一樣，一個是 k 一個是 μ，如果要求的是 μ 就要注意自己用的是什么方法，不然可能就出來的是 k，但是也只要轉換下就好，公式如下。
$$μ=\frac{k}{ln2}$$

##4 作圖法求倍增時間（代際時間）g

如果上面不想看，就直接看怎么求吧。

• 對於一條生長曲線（growth curve），其實除了指數生長期還有其他幾個區域。求 g 的步驟主要包括：
  • 測定時間和生長度量，細菌一般是吸光度，optical density。
  • 判斷指數生長的范圍。
  • 找到倍增的區域，計算相應的時間（g）。

數據准備

• 時間t，OD值。

判斷指數生長范圍

• 左圖：t為X軸，OD為Y軸。

• 右圖：t為X軸，OD取log10為Y軸。
  

• 根據右圖里的線是不是直線判斷這個時候細菌是不是在指數生長范圍，從右圖可以看出來第5到7個點處於這個范圍。

• 一般比較老的書里面給的都是直接作圖法，也就是說你需要一把尺子。 用R來模擬下這個過程。

作圖求解

• 需要知道：在對數坐標軸的的基礎上，在什么范圍里面OD值翻倍。直接從坐標軸上面看不出來。我們還需要知道原始的OD值，下圖左邊是對數坐標軸，右邊是原始的坐標軸。
  
• 看起來0.1-0.2,0.2-0.4是兩個翻倍的區域。
• 以前你需要拿出尺子，沿着紅線測一測對應的時間是多少，然后做個減法。
• R里面可以用 locator() 函數來測定相應的點坐標。我取的OD = 0.2和0.4的兩個點，算出來是 4.73。
• 因為這個區域其實是線性的，也可以通過回歸求斜率。 然后求Y軸變化為log2的時候的X軸變化。求出來是 4.41。
• 為啥有一點點差距，因為實際上 OD = 0.4 的時候微微偏離直線范圍了。
• 代碼如下，數據為真實數據。

dt = data.frame(time = c(0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,48,52),
                OD600 = c(0.0479,0.0472,0.0504,0.0668,0.1084,0.2123,0.3812,0.6231,0.791,0.9484,
                                  1.1135,1.1099,1.189,1.1402))
dt$lg <- log10(dt$OD600)
colnames(dt) <- c("time", "OD600","lg")

par(mfrow=c(1,2))
plot(type = "b", dt$time,dt$OD600, xlab = "Time(h)", ylab = "OD600")
plot(type = "b", dt$time,dt$lg, pch=19, xlab = "Time(h)", ylab = "lg(OD600)" )
par(mfrow=c(1,1))


plot(type = "l", dt$time,dt$lg, pch=19, xlab = "Time(h)", ylab = "lg(OD600)" )
      abline(h = log10(c(0.1, 0.2, 0.4,0.8,1.0,1.2)), col = "pink")
abline(v = seq(0,50,by=10), col = "grey")
points(dt$time,dt$lg, pch=19)
axis(4, log10(c(0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2)), as.character(c(0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2)), 
       col.ticks = "pink")
t1 <- locator() # 鼠標點選位置（吸光度為0.2）
t2 <- locator() # 鼠標點選位置（吸光度為0.4）
points(t1, pch=4, col = "red", cex = 1.5, lwd = 0.4)
points(t2, pch=4, col = "red", cex = 1.5, lwd = 0.4)

segments(t1$x, t1$y, t1$x, log10(0.1),"red")
arrows(t1$x,log10(0.1),t2$x,log10(0.1), col = "red", length = 0.1,code =3)
text(t1$x+(t2$x-t1$x)/2,log10(0.09), labels = paste0(round(t2$x-t1$x,2),"h"))
segments(t2$x,log10(0.1),t2$x,t2$y,"red")

# 回歸來求
dt.lm <- dt[5:7,]
abline(lm(data = dt.lm, lg~time), col="blue", lty = "longdash")
g <- round(log10(2)/coef(lm(data = dt.lm, lg~time))[2],2) # 倍增時間所以y2/y1=2
mtext(text = paste0("calculated generation time is ",bquote(.(g)), "h."), adj=0)

##5 最后 * 嗯，終於不擔心自己算的g是錯的了。 * 對於其他的生物量度量也是用相同的方法。 * 不管是specific growth rate，generation time都是針對指數生長的時期，可以理解為不受初始量和環境條件影響的生長能力，不要用錯了地方。
##6 參考文獻 [[1] 細菌生長過程的描述 wikipedia](https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth) [[2] 關於細菌生長的一篇文獻](http://www.stewartcalculus.com/data/BIOCALCULUS/BB/BB_Chapter2/E2.2.1/Monod%201949.pdf) [[3] 絲狀菌的 *K _r* 和 specific growth rate的關系](http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1304506&tool=pmcentrez&rendertype=abstract) [[4] 推導過程 關於k](http://miller-lab.net/MillerLab/protocols/general-bacteriology/calculating-growth-rate/) [[5] 推導過程 關於μ](http://wiki.biomine.skelleftea.se/wiki/index.php/Microbial_growth) [[6] 使用分光光度法計算代際時間的全過程](http://www.sas.upenn.edu/LabManuals/biol275/Table_of_Contents_files/6-BacterialGrowthCurve.pdf) [[7] 另外一個計算過程](http://faculty.sdmiramar.edu/dtrubovitz/micro/microhandouts/labs/growthcurve.pdf) [[8] 方法+計算但是里面OD直接用來計算，並沒有對數轉換](http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=1105&cnt=1)，我覺得就是這篇誤導了我。 [[9] 對數換底公式](https://baike.baidu.com/item/%E6%8D%A2%E5%BA%95%E5%85%AC%E5%BC%8F)推導中間發現不記得了。