微生物+计算细胞倍增时间

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## 1 简介 虽然做生长曲线和求代际时间貌似是个很简单常规的东西，可是到我一直不大确定自己求的对不对... 这次下定决心不再乱做... 不看解释，跳到[作图](#tag)
## 2 定义 ### 微生物 * 细菌，真菌

培养和测定

• 细菌：液体培养，不同的时间测定OD₆₀₀的吸光度。固体培养稀释涂布测定colony forming unit（CFU）数量。
• 真菌：平皿固体培养，不同时间测定半径。

对 细菌 来说每个细胞都有分裂能力，但是真菌只有尖端的细胞在进行分裂，后面的细胞在增长（Chang）。

描述生长的一些度量

• 瞬时生长速度（growth rate）：

  • 细菌：在单位时间里测量值得变化。
  • 真菌：径向生长速度：radial growth rate K_r，有的时候叫colony radial growth rate。
  • 单位：测量单位/单位单位，比如CFU/h，μm/h。
  • 生长速度与生长条件，初始浓度等有关系。

• 单位生长率（specific growth rate），μ 表示。

  • 描述的是在指数生长期的生长能力。
  • 单位是 时间-1，可以是任何时间单位，通常用 h-1。

• 相对生长速度（relative growth rate） 相对当前生物量的生长速度，如果大小为一个常数，则用 k 表示。

  • 因为在德语里面常量是 konstant 所以缩写成 k，有的时候又用的 C 表示常量，嗯，是 constant。
  • 单位也是 时间-1。
  • 注意 k 和 μ 不一样。

• 细胞倍增时间（doubling time）：t_d，也称为代际时间，代时（generation time）：g。

  • \(g=1/μ\)
  • \(g=ln2/k\)

从这里也能看出 μ 和 k有个倍数差距。后面公式推导再说明。

说明

• 细菌测定是OD不是细胞数量，如果要知道绝对数量需要测定OD和CFU之间的关系。
• 不管原始数据是什么，其形式都是X：t1到t2的时间点 ，Y:生长状态的度量。
• Y轴取对数，指数生长期为一条直线。这是判断指数生长的标准。
• 【重点】生长速度 描述的是一种状态，而 k 和 μ 是一种能力，他们之间没有特定的转换关系，但是你能计算出当微生物以 k 能力生长的时候，它的 生长速度 是多少。

## 3 公式推导 然后为啥我一直搞不太清楚，是因为微积分全部忘记了。最近在二手市场买了同济的高数，当时摆摊的小哥祝我考研顺利，嗯，如果一切可以重来...说远了

什么是分裂

情况1

• 从时间（t）角度来看
  • 分裂是一个1变2，2变4的过程，如果 每1秒钟 细胞发生一次分裂，t时间 之后，从 1个 细胞能够增加到 2^t 这种量和时间的关系为指数关系。
    $$P(t)={P}_{o}{2}^{t}$$
    其中，
    P -- population size，种群大小。
    P_o -- 初始的种群大小。
    t -- 时间，常用单位小时 h。

情况2

• 从代际（generation）的角度来看：
  • 分裂是一个1变2，2变4的过程，如果 每1代 细胞发生一次分裂，n代 之后，从 1个 细胞能够增加到 2^t 这种量和时间的关系为指数关系。
    $$P(n)={P}_{o}{2}^{n}$$
    其中，
    P -- population size，种群大小，理解为细胞个数。
    P_o -- 初始的细胞个数。
    n -- 细胞数量翻倍的代际数。
    g -- generation time，细胞倍增时间，常用单位小时 h。
    μ -- specific growth rate，定义 \(μ=1/g\)，单位 h^-1。

注意 μ 是人为定义的，因为分裂发生的实际间隔是代际的长度，而非平常的秒和小时，所以情景1其实是一个特例。

• 如何计算 g
  • 已知 P(t₂)/P(t₁) = 2， n = t/g。
  • 用t代替n，在t₂和t₁时间：
    $$P\left({t}_{1}\right)={P}_{o}{2}^{{t}_{1}g}$$
    $$P\left({t}_{2}\right)={P}_{o}{2}^{{t}_{2}g}$$
• 把P_o移到等式左边，等式两边取10为底数的对数，然后两个做减法，推导出。
  $$g={{t}_{2}-{t}_{1}}{}$$

也就是说，我们只是需要知道在指数增长范围内，那两个时间点数量发生了倍增。嗯，废话。这不就是g的定义。不过这个就是作图的原理。

k和μ的关系

• 上面对分裂的定义已经能算出 μ 和 g了，那 k 是啥？
  • 我理解的是，假设你不知道分裂可以用以2为底数的指数函数描述，而从分裂速度来描述分裂的过程，推导过程中定义的一个常数。

解释k用到的基本概念

• W :一种生物量当前的的 度量，可以是重量，半径，浊度。
• t :时间。
• 瞬时生长速度（growth rate）：\(dW/dt\)。

如果你忘了 d 是什么，就理解成很小。所以，以上表示在很短时间内，生物量的变化。

• 相对生长速度（relative growth rate）：
  $$\frac{1}{W}\frac{dW}{dt}$$
  • 为什么关心相对的速度？
  • 假设1个细胞，1秒之后变成了2个，这1秒内的生长速度（growth rate）是（2-1）个/1s=1个/s。
  • 假设4个细胞，1秒之后变成了8个，这1秒内的生长速度（growth rate）是（8-1）个/1s=7个/s。
  • 差的有点多，因为初始量不一样，而我们关心的是生长的能力，不是初始量有什么不同，所以需要相对生长速度。

情况3

• 如果相对生长速度是一个常数 k，这就是细胞分裂的过程。
  $$\frac{1}{W}\frac{dW}{dt}=k$$

  • wiki里面写的是不难推出这是一个指数函数。摔，凭啥？这不是小时候不会解题的惯用招数？

  • 在高数书的帮助下发现，的确不难推出，嘤嘤嘤。

  • 如果你和我一样渣，可以看看下面不难推出的过程。

  • 等式两边积分
    $$\int \frac{dW}{W}=\int kdt$$

  • 书上说左边不定积分结果是 \(ln|W|+C\)

  • 书上说右边不定积分结果是 \(kt+C\)

  • 已知W>0，生物量变化这个阶段量应该都是正的吧。
    $$lnW=kt$$
    $$W={e}^{kt}$$

嗯，真的是指数函数。

如何求 k ？

• 时间 t₁ 和 t₂ 之间定积分吧。
  $$\int_{{t}_{1}}^{{t}_{2}} \frac{dW}{W}=\int_{{t}_{1}}^{{t}_{2}} kdt$$
  $$ln({W}_{2}/{W}_{1})=k({t}_{2}-{t}_{1})$$
  $$k=\frac{ln{W}_{2}-ln{W}_{1}}{{t}_{2}-{t}_{1}}$$

• 如果知道了时间和相应的W，就能计算 k。通常计算用的10为底，将对数的底数从e换成10。
  $$k=\frac{{log}_{10}{W}_{2}-{log}_{10}{W}_{1}}{{t}_{2}-{t}_{1}\times {log}_{10}e}$$

• 计算倍增时间 g 或者t_d，倍增也就是 W₂ = 2W₁，t₂-t₁ = g，带入到上面的方程。
  $$g=\frac{ln2}{k} $$

到这一步就能看出来，生长既可以用2为底数又可以用自然对数为底的指数函数描述，不一样的函数计算的 g 都是一样的。也应该一样。但是用来描述函数的常数不一样，一个是 k 一个是 μ，如果要求的是 μ 就要注意自己用的是什么方法，不然可能就出来的是 k，但是也只要转换下就好，公式如下。
$$μ=\frac{k}{ln2}$$

##4 作图法求倍增时间（代际时间）g

如果上面不想看，就直接看怎么求吧。

• 对于一条生长曲线（growth curve），其实除了指数生长期还有其他几个区域。求 g 的步骤主要包括：
  • 测定时间和生长度量，细菌一般是吸光度，optical density。
  • 判断指数生长的范围。
  • 找到倍增的区域，计算相应的时间（g）。

数据准备

• 时间t，OD值。

判断指数生长范围

• 左图：t为X轴，OD为Y轴。

• 右图：t为X轴，OD取log10为Y轴。
  

• 根据右图里的线是不是直线判断这个时候细菌是不是在指数生长范围，从右图可以看出来第5到7个点处于这个范围。

• 一般比较老的书里面给的都是直接作图法，也就是说你需要一把尺子。 用R来模拟下这个过程。

作图求解

• 需要知道：在对数坐标轴的的基础上，在什么范围里面OD值翻倍。直接从坐标轴上面看不出来。我们还需要知道原始的OD值，下图左边是对数坐标轴，右边是原始的坐标轴。
  
• 看起来0.1-0.2,0.2-0.4是两个翻倍的区域。
• 以前你需要拿出尺子，沿着红线测一测对应的时间是多少，然后做个减法。
• R里面可以用 locator() 函数来测定相应的点坐标。我取的OD = 0.2和0.4的两个点，算出来是 4.73。
• 因为这个区域其实是线性的，也可以通过回归求斜率。 然后求Y轴变化为log2的时候的X轴变化。求出来是 4.41。
• 为啥有一点点差距，因为实际上 OD = 0.4 的时候微微偏离直线范围了。
• 代码如下，数据为真实数据。

dt = data.frame(time = c(0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,48,52),
                OD600 = c(0.0479,0.0472,0.0504,0.0668,0.1084,0.2123,0.3812,0.6231,0.791,0.9484,
                                  1.1135,1.1099,1.189,1.1402))
dt$lg <- log10(dt$OD600)
colnames(dt) <- c("time", "OD600","lg")

par(mfrow=c(1,2))
plot(type = "b", dt$time,dt$OD600, xlab = "Time(h)", ylab = "OD600")
plot(type = "b", dt$time,dt$lg, pch=19, xlab = "Time(h)", ylab = "lg(OD600)" )
par(mfrow=c(1,1))


plot(type = "l", dt$time,dt$lg, pch=19, xlab = "Time(h)", ylab = "lg(OD600)" )
      abline(h = log10(c(0.1, 0.2, 0.4,0.8,1.0,1.2)), col = "pink")
abline(v = seq(0,50,by=10), col = "grey")
points(dt$time,dt$lg, pch=19)
axis(4, log10(c(0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2)), as.character(c(0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2)), 
       col.ticks = "pink")
t1 <- locator() # 鼠标点选位置（吸光度为0.2）
t2 <- locator() # 鼠标点选位置（吸光度为0.4）
points(t1, pch=4, col = "red", cex = 1.5, lwd = 0.4)
points(t2, pch=4, col = "red", cex = 1.5, lwd = 0.4)

segments(t1$x, t1$y, t1$x, log10(0.1),"red")
arrows(t1$x,log10(0.1),t2$x,log10(0.1), col = "red", length = 0.1,code =3)
text(t1$x+(t2$x-t1$x)/2,log10(0.09), labels = paste0(round(t2$x-t1$x,2),"h"))
segments(t2$x,log10(0.1),t2$x,t2$y,"red")

# 回归来求
dt.lm <- dt[5:7,]
abline(lm(data = dt.lm, lg~time), col="blue", lty = "longdash")
g <- round(log10(2)/coef(lm(data = dt.lm, lg~time))[2],2) # 倍增时间所以y2/y1=2
mtext(text = paste0("calculated generation time is ",bquote(.(g)), "h."), adj=0)

##5 最后 * 嗯，终于不担心自己算的g是错的了。 * 对于其他的生物量度量也是用相同的方法。 * 不管是specific growth rate，generation time都是针对指数生长的时期，可以理解为不受初始量和环境条件影响的生长能力，不要用错了地方。
##6 参考文献 [[1] 细菌生长过程的描述 wikipedia](https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth) [[2] 关于细菌生长的一篇文献](http://www.stewartcalculus.com/data/BIOCALCULUS/BB/BB_Chapter2/E2.2.1/Monod%201949.pdf) [[3] 丝状菌的 *K _r* 和 specific growth rate的关系](http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1304506&tool=pmcentrez&rendertype=abstract) [[4] 推导过程 关于k](http://miller-lab.net/MillerLab/protocols/general-bacteriology/calculating-growth-rate/) [[5] 推导过程 关于μ](http://wiki.biomine.skelleftea.se/wiki/index.php/Microbial_growth) [[6] 使用分光光度法计算代际时间的全过程](http://www.sas.upenn.edu/LabManuals/biol275/Table_of_Contents_files/6-BacterialGrowthCurve.pdf) [[7] 另外一个计算过程](http://faculty.sdmiramar.edu/dtrubovitz/micro/microhandouts/labs/growthcurve.pdf) [[8] 方法+计算但是里面OD直接用来计算，并没有对数转换](http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=1105&cnt=1)，我觉得就是这篇误导了我。 [[9] 对数换底公式](https://baike.baidu.com/item/%E6%8D%A2%E5%BA%95%E5%85%AC%E5%BC%8F)推导中间发现不记得了。