任務列表
- 比對軟件
- hisat2的用法
- 下載index文件
- 比對、排序、索引
- 質量控制
- 載入IGV，截圖幾個基因
hisat2的用法
本作業是比對到基因組，所以使用gapped or splices mapper，此流程已經更新。TopHat首次被發表已經是7年前，STAR的比對速度是TopHat的50倍，HISAT更是STAR的1.2倍。HISAT2是TopHat2/Bowti2的繼任者，使用改進的BWT算法，實現了更快的速度和更少的資源占用，作者推薦TopHat2/Bowti2和HISAT的用戶轉換到HISAT2。
官網：https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml（學習一個軟件最好的方法就是結合現有中文資料，加上閱讀官方說明書和HELP文檔，一般剛開始學習的時候先使用默認參數，不要亂調參數）
下載index文件
cd ~/reference mkdir -p index/hisat && cd index/hisat wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/mm10.tar.gz tar zxvf hg19.tar.gz tar xvzf mm10.tar.gz
-c：斷點續傳
比對、排序、索引
把fastq格式的reads比對上去得到sam文件，接着用samtools把它轉為bam文件，並且排序（注意N和P兩種排序區別）索引好（可以使用管道實現，省去中間SAM保存的過程，直接輸出BAM文件）
編寫bash腳本：map.sh
#! usr/bin/bash
set -u
set -e
set -o pipefail
hg19_ref=/mnt/hgfs/2017/reference/index/hisat/hg19/genome
mm10_ref=/mnt/hgfs/2017/reference/index/hisat/mm10/genome
data_path=/mnt/hgfs/2017/rna_seq/data
NUM_THREADS=25
ls --color=never Homo*1.fastq.gz | while read id;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2 -t -p $NUM_THREADS -x $hg19_ref -1 $data_path/${id%_*}_1.fastq.gz -2 $data_path/${id%_*}_2.fastq.gz 2 > ${id%_*}_map.log | samtools view -Sb - > ${id%_*}.bam);done
ls --color=never Mus*1.fastq.gz | while read id;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2 -t -p $NUM_THREADS -x $mm10_ref -1 $data_path/${id%_*}_1.fastq.gz -2 $data_path/${id%_*}_2.fastq.gz 2 > ${id%_*}_map.log | samtools view -Sb - > ${id%_*}.bam);done
ls --color=never *.bam | while read id;do(samtools sort --threads $NUM_THREADS $id -o ${id%.*}_sorted.bam);done
ls --color=never *_sorted.bam | while read id;do(samtools index $id);done
運行腳本：
bash map.sh
質量控制
對bam文件進行簡單QC
Reads比對后的質量控制(評估比對質量的指標)
比對上的reads占總reads的百分比；
Reads比對到外顯子和參考鏈上的覆蓋度是否一致；
比對到基因組序列，多重比對reads；
相關質控軟件除了Picard，RSeQC，Qualimap還有一大堆