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KEGG 數據庫中，把功能相似的蛋白質歸為同一組，然后標上 KO 號。通過相似性比對，可以為未知功能的蛋白序列注釋上 KO 號。通過KEGG數據庫的注釋極大的方便我們進行生物學通路的研究，可以直接查看物種某條生物學通路上基因的存在情況。
最簡單的方法是看公司給的KEGG注釋或者直接下載本物種每個基因的注釋結果（比如，植物Phytozome；動植物Ensemble），然后對應到自己的差異基因集里面。
當然如果自己的物種沒有KEGG注釋結果，那只能自己動手了！
截止到 2015 年 6 月 12 日，KEGG 數據庫中共收錄了 3,904 個完整的基因組。其中 304 個為真核生物，3,600 個為原核生物。在真核生物中，共有 299 個物種（一個物種可能不止一個基因組），分為 172 科，227 屬；在原核生物中，共有 1,858 個物種，分為 809 屬。
KEGG 對這些物種的基因序列構成了一個非冗余的 KEGG GENES 數據庫；通過 BlastKOALA 和 GhostKOALA， 可對用戶提交的蛋白質序列，與 KEGG GENES 數據庫分別進行 BLAST 或 GHOSTX 相似性比對，為蛋白質序列注釋上 K number，即 KO 號。其中，GHOSTX 比對和 BLAST 比對類似，能夠檢測到分歧度較大的同源序列（remote homologues），在速度上比 BLAST 大約快 100 倍，兩者的區別是：
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BlastKOALA：用於注釋高質量基因組，只能提交 5,000 - 10,000 條蛋白質序列。
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GhostKOALA：用於注釋宏基因組，文件大小為 300 M 以內。
有了 KO 號，就可以重構 KEGG 數據庫中的 KEGG pathways 及其他分子網絡，然后進行其它分析。
這里以 BlastKOALA 為例，對蛋白質序列進行 KO 注釋。
分析步驟如下：
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到這個網頁：http://www.kegg.jp/blastkoala/
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上傳 fasta 格式的蛋白質序列
選擇物種所屬的分類單元，如這里選擇植物“plant”
選擇一個數據庫進行比對。這些數據庫由 KEGG GENES 分別在種、屬、科水平去冗余后生成。這里選“屬”水平的真核生物，如下圖右表所示，上傳的蛋白質序列限制為 7,500 條序列。
填寫自己的郵箱地址，並提交任務，開始分析
回跳轉到這個界面，耐心等待即可
分析完成后，會收到郵件通知。
點擊鏈接，返回如下結果。需要注意的是分析結果會在 7 天后刪除，所以盡快將結果下載到本地。
在這個結果界面，可以查看 pathway 等信息。
Reference: Kanehisa, M., Sato, Y., and Morishima, K. (2016) BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG tools for functional characterization of genome and metagenome sequences. J. Mol. Biol. 428, 726-731.