單細胞流程跑了不少，但依舊看不懂結果，是該好好補補了。
有些人可能會誤會，覺得單細胞的RNA-seq數據很好分析，跟分析常規的RNA-seq應該沒什么區別。今天的這篇文章2015年3月發表在Nature Genetics Review上，專門說明了一下單細胞RNA測序數據在數據分析和計算上的挑戰（雖然已經過去1年多了，這里指出的問題和挑戰仍然是不過時的，至於這些問題和挑戰現在是不是完美解決了，這里就暫且先不討論了。）。
主要說了以下問題：
1. 單細胞RNA測序 (single cell RNA sequencing，以下簡稱scRNA-seq)數據質控和歸一化（Normalization），其實主要是歸一化。
次要還涉及了以下問題：
2. 單細胞測序應該測多少深度合適，即測幾個G的數據量。
3. 批次效應（batch effect）的問題。
另外，我在另一篇文章中看到的，也很有意思：
很多基因表達值為0的問題，當然這個也可以歸類到歸一化的問題中去。
1. spike-in. 在說明問題之前，首先要明確一下實驗設計。有一個方法，which is strongly recommended for all scRNA-seq實驗，那就是使用spike-in，而spike-in最廣泛的就是ERCC。有些實驗的protocol，使用3‘或5’端的特征序列（unique melocular identifier, UMI）來當barcode，但還是同時加上spike-in的好，加上spike-in之后，這種實驗方法可以幫助后期分析繞開擴增中產生的biases這一問題，而擴增biases是技術不穩定的最主要的一個來源。所以，強調一點，單細胞RNA-seq要做spike-in.
2. 分析pipeline. 之前針對常規RNA-seq的分析pipeline大部分還是可以公用的，比如：原始數據的回貼就可以沿用TopHat或者GSNAP等，數read counts還是可以用HTseq，樣本的聚類，差異表達分析等都可以沿用常規RNA-seq的pipeline。
3. 但是QC和Normalization這兩步，單細胞測序要格外小心。QC的時候，除了要注意常規的RNA-seq的QC條目，單細胞中非常重要的一點是還要確認RNA是否有降解。這點可以通過看總的回貼片段及回貼到spike-in上的片段的比例。（這里其實有個問題：如果RNA降解很嚴重，還能夠反轉擴增成功嗎？我個人猜測可能會比較難。）
總結下，單細胞的QC可以分成以下三步：Fastqc，HTseq（數reads后，看reads回貼在哪里，下圖展示的是統計整理之后的樣子）及PCA。
以下插播一段題外話：PCA的圖可以長成下面這樣。PCA挺有用的，不管是單細胞測序還是常規測序，特別是樣本量多的時候。
（圖片來源：Petropoulos et al., 2016, Cell 165, 1012–1026）
4. Normalization. 我們對常規的RNA-seq做歸一化有RPKM，FPKM或者read counts，且這種歸一化基於一個假設，即這些細胞中的RNA的量是一樣多的。但是，如果沒有spike-in的話，我們沒有辦法知道一個細胞里面到底有多少RNA，也就沒有辦法做歸一化。然而加入spike-in之后，細胞大小測序深度的不一致也會使得常用的歸一化方法不適用。這篇綜述提到的方法是Philip Brennecke 2013年發表在nature method上的，首先根據測序深度和細胞中的RNA的量對read counts進行歸一化，然后再針對spike-in和自己本身的RNA計算樣本間的變異系數。不過這個方法，后來又被另外一個方法（也是發表在nature method上的
，Dominic Grün，2014年）嫌棄了。尚無定論。
5. 測序深度。這個每個人也有每個人的做法。基本原則是：
sequenced the library to a sufficient depth to ensure that each cDNA molecule is observed at least once. 看上去有點玄乎（個人感覺：一般6-8G），細胞量越少，測序深一點，這兩者有個balance。
6. batch effect. Batch effect的問題在scRNA-seq中更為顯著、嚴重。
One way to overcome this problem is to increase the number of biological replicates. 一種辦法是增加重復樣。有沒有別的辦法，文章沒有提。