ITS簡要分析流程(using Qiime)

Qiime安裝

參考資料：http://blog.sina.com.cn/s/blog_83f77c940101h2rp.html

Qiime script官方說明http://qiime.org/scripts/index.html

一般ITS數據簡要分析過程

reference下載：https://github.com/downloads/qiime/its-reference-otus/its_12_11_otus.tar.gz

其中97_* 和99_*分別是相似度97和99的reference

以下過程僅做參考，具體根據詳細項目更改，

1   質控 

對數據進行質量控制，去除低質量數據

2   拼接

針對不同平台數據，采用相應的拼接軟件拼接，根據contig長度，方差，N50（主要）等指標使用最佳k-mer值

3   pick_otus.py 

官方文檔：http://qiime.org/scripts/pick_otus.html；

從fasta文件中提取OTUs，提取方法可選，具體有cd-hit，blast，Mothur，usearch等等

具體使用方法：

python pick_otus.py -i seqs.fna -o picked_otus_default

-i參數指定輸入序列，-o參數指定輸出文件目錄，輸出文件為seqs_otus.txt和seqs_otus.log，-m可指定提取方法，更多具體參數說明參見官方文檔

4   assign_taxonomy.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html

使用下載的reference中的rep_set和 taxonomy文件夾中對應的文件，對序列分類，使用方法：

python assign_taxonomy.py –i seqs.fna -r <otus_dir>/rep_set/97_otus.fasta -t <otus_dir>/taxonomy/97_otu_taxonomy.txt

更多具體參數說明參見官方文檔，輸出文件示例：tax_assignments.txt

5   make_otu_table.py 

官方文檔：http://qiime.org/scripts/make_otu_table.html

將提取出的seqs_otus.txt和分類文件tax_assignments.txt制作成out_table，即.biom文件

使用方法：

python make_otu_table.py -i otu_map.txt -t tax_assignments.txt -o otu_table.biom

 

6   pick_open_reference_otus.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/pick_open_reference_otus.html

以上三個步驟可以通過Qiime中自帶的pick_open_reference_otus.py流程完成，將需要使用到的參數寫到文件params.txt中，並通過-p參數調用，param文件說明文檔: http://qiime.org/documentation/qiime_parameters_files.html

7   summarize_taxa_through_plots.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html

統計各個樣品中的OUT中物種豐度信息，並從門綱目科屬水平分別繪制物種豐度bar圖

python summarize_taxa_through_plots.py -o taxa_summary -i otu_table.biom 在輸出文件夾中，雙擊html文件即可觀察bar圖

8   alpha_rarefaction.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/alpha_rarefaction.html

對拼接后的reads

使用示例：python alpha_rarefaction.py -i otu_table.biom -o arare/ -m map.txt，對reads進行隨機抽樣，得到的序列數和out數目比較，做出稀釋曲線圖，得到同樣可以通過html文件查看

9   alpha_diversity.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/alpha_diversity.html

使用示例：python alpha_diversity.py -i otu_table.biom -m chao1 -o adiv_chao1.txt，單樣品多樣性分析，繪制Alpha多樣性bar圖

10　統計.biom文件長度，並選取最短長度作為beta多樣性的深度參數

可以借助ipython工具中提供的biom summarize-table方法，選取最短長度n，作為下一步驟中-e 參數（覆蓋深度）

11　beta_diversity_through_plots.py

官方文檔：http://qiime.org/scripts/beta_diversity_through_plots.html

該流程包含beta_diversity.py principal_coordinates.py make_prefs_file.py三個腳本，能夠給出(un)weignted unifrac距離矩陣，並做出2D和3D的PCoA圖形

使用示例：python beta_diversity_through_plots.py -i otu_table.biom -o bdiv_even100/ -m map.txt -e 100，使用-p參數指定距離范式