前面所及的都是標准的殘基，所以我們不用為非標准的殘基創建的單元和提供我們自己的參數。這章我們將介紹一種方法對於非標准的殘基。以含有銅離子的質體藍素蛋白為例。需要作的是：
1)銅離子由四個氨基酸幫定His37, Cys84, His87 和 Met92。我們將修飾這些氨基酸並提供新鍵類型的參數
2)應該保留晶體本身的水分子。但是癢的位子應該被指定所以用Xleap來增加丟失的質子。所以在運行模擬前要進行最小化這些位置。
3)不尋常的pdb文件含有顯性的質子層。這種情況我們去除不能識別的質子並讓leap來增加他們。
4)質子化的蛋白有－9電荷，我們需要增加9個Na+抗性離子來中和這個系統。
stage1 --pdb文件的編輯：
我們將用PDB文件：1PLC - 1PLC.pdb.
這個文件的前面寫道：waters #187 and #183 form a disordered pair and so both should not be present.
（REMARK 4 1PLC 83
REMARK 4 HOH 187 AND HOH 183 FORM A DISORDERED PAIR AND BOTH ARE NOT 1PLC 84
REMARK 4 PRESENT SIMULTANEOUSLY. 1PLC 85）
所以我們除去水187並保留183，而且也除去在leap中不能用的數據(如最后的CONECT內容)。正常的情況下我們應該增加TER cards在沒有結合到鏈上的殘基，但在水溶劑的情況下不用這樣做，因為這個被定義在WAT unit中。注：如果用不同的溶劑，它是必須的增加TER。
由於pdb件不區分參與鍵或其他東西的半胱氨酸殘基，需要編輯半胱氨酸殘基。對於有規律的質子化殘基的名字為CYS;對於去質子化或綁定到金屬離子的名字為CYM；對於涉及到二硫鍵或其它鍵的為CYX。由於在文件中的半胱氨酸84涉及到金屬離子
所以需要改變CYS到CYM。The same is true for histidine residues which can be protonated in the 'delta' position (HID), the epsilon position (HIE) or at both (HIP). Fortunately in plastocyanin this is fairly easy since there are only two histidine residues (37 and 87) both of which are bonded to the copper via the 'delta' nitrogen. Thus they must both be protonated on the epsilon nitrogen. We will thus change both histidine residue names (37 and 87) from HIS to HIE. Leap will then add the correct number of protons in the correct positions.修飾后的文件為：1PLC_mod.pdb
接下來去除非標准的氫原子。它是可能的用質子化來糾正非標准的氫原子，從NMR轉到PDB，實驗顯示在NMR結構的氫位置是不能相信的。因此最好的方法是去除所有的質子(一般在13列或14)並且讓leap在標准的位置增加它們。產生的文件為：1PLC_mod2.pdb
除去質子：grep -v '.............H' 1PLC_mod.pdb > 1PLC_mod2.pdb. 模擬需要的氫原子和水分子將在leap中添加
接下來做的是怎樣處理銅離子。簡單的處理一下
編輯pdb文件把CU改為CUA；
原始的pdb文件含有一些氨基殘基可選擇用的參數：如LYS30
最后在銅離子和初始晶體水分子間加一個TER。(作用是不讓銅離子成為蛋白鏈的一部分而使蛋白不穩定)。
stage2--創建非標准的CUA單元
有三種方法：
(1):最簡單是利用Antechamber來創建，(2)在xleap中編輯CU殘基。(3)創建一個新的庫文件非標准殘基，特別對於輔酶和NAD，我們用第三個。
我們可以現導入1PLC_mod_final.pdb文件來來檢測殘基的識別。
$ tleap
>source leaprc.ff99
>1PLC=loadpdb 1PLC_mod_final.pdb
會返回 Creating new UNIT for residue: CUA sequence: 100
Created a new atom named: CU within residue: .R<CUA 100>
total atoms in file: 894
Leap added 922 missing atoms according to residue templates:
922 H / lone pairs
The file contained 1 atoms not in residue templates
在模板中沒有CUA殘基。
創建CUA單元
最快的方法是從1PLC_mod_final.pdb 文件中剪切出來並保存為一個pdb文件cua.pdb。復制一句話
載入文件：
$ tleap
>source leaprc.ff99
> CUA = loadpdb cua.pdb
> edit CUA
接下來是指定這個原子的類型和電荷
需要計算銅原子的電荷和其有關系的殘基的電荷，由於銅原子能使靜電荷發生變化。在AMBER中應用Restrained Electrostatic Potential Method (RESP)來做。在這里就不計算了(教程在AMBER website)，假設銅原子為＋１價且不影響周圍的殘基。
在Manipulation上選擇select button並點擊分子，會發生顏色的變化。讓后去Edit menu Edit->Edit Selected Atoms：在TYPE中填入CU,在CHARGE中填入1.0000. 然后選擇Table->Save and Quit，關閉編輯窗口。在命令行中鍵入：
>decs MET (看這個新的單元頭原子和尾原子，被用來聯系蛋白鏈)
但是當鍵入decs CUA時，會發生：
UNIT name: CUA
Head atom: null
Tail atom: null
因為銅原子不是蛋白的一部分。如果創建了蛋白上氨基的新單元，你需要用這個命令顯示那個原子是頭原子和那個原子是尾原子。
保存完整的庫文件：
> saveoff CUA cua.lib
stage3 --載入蛋白和創建庫文件
在xleap中看缺失參數：
為了讓xleap識別新的殘基在導入1PLC_mod_final.pdb文件時，我們需要現載入新的庫文件：
$AMBERHOME/exe/xleap -s -f $AMBERHOME/dat/leap/cmd/leaprc.ff99
>loadoff cua.lib
> 1PLC = loadpdb 1PLC_mod_final.pdb
接下來確保於銅原子作用的所有鍵被定義。我們需要增加在銅原子於半胱氨酸（84）硫原子的鍵，銅原子於甲硫氨酸(92)硫原子的鍵和兩個組氨酸(37 & 87)的三角洲氮於銅原子的鍵。
> bond 1PLC.37.ND1 1PLC.100.CU
> bond 1PLC.87.ND1 1PLC.100.CU
> bond 1PLC.84.SG 1PLC.100.CU
> bond 1PLC.92.SD 1PLC.100.CU
注：DESC命令可以列出的殘基和原子名稱，因此可以識別結合的原子，如desc 1PLC.CUA.
接下來加水（a truncated octahedral box of TIP3P water.）
> solvateoct 1PLC TIP3PBOX 12
中性化我們的系統：
> addions 1PLC Na+ 9 （check 1PLC）
現在保存 prmtop and inpcrd 文件，發現xleappppp不能識別CU
> saveamberparm 1PLC 1PLC.prmtop 1PLC.inpcrd
是因為在標准立場中不存在CU，通過檢查1PLC會發現由於溶劑的作用使大部分失去作用，丟失的參數於新類型CU有關。
> check 1PLC
所以我們需要增加這些參數到AMBER立場中，在關閉xleap前因該保存1PLC庫以便重復以上的步驟。
> saveoff 1PLC 1PLC.lib
stage4 --創建Prmtop and Inpcrd 文件
創建立場文件：plc.frcmod
# modifications to force field for poplar plastocyanin
MASS
CU 65.36
BOND
NB-CU 70.000 2.05000 #kludge by JRS
CU-S 70.000 2.10000 #kludge by JRS
CU-SH 70.000 2.90000 #for pcy
CT-SH 222.000 1.81000 #met(aa)
ANGLE
CU-NB-CV 50.000 126.700 #JRS estimate
CU-NB-CR 50.000 126.700 #JRS estimate
CU-NB-CP 50.000 126.700 #JRS estimate
CU-NB-CC 50.000 126.700 #JRS estimate
CU-SH-CT 50.000 120.000 #JRS estimate
CU-S -CT 50.000 120.000 #JRS estimate
CU-S -C2 50.000 120.000 #JRS estimate
CU-S -C3 50.000 120.000 #JRS estimate
NB-CU-NB 10.000 110.000 #dac estimate
NB-CU-SH 10.000 110.000 #dac estimate
NB-CU-S 10.000 110.000 #dac estimate
SH-CU-S 10.000 110.000 #dac estimate
CU-SH-CT 50.000 120.000 #JRS estimate
CT-CT-SH 50.000 114.700 #met(aa)
HC-CT-SH 35.000 109.500
H1-CT-SH 35.000 109.500
CT-SH-CT 62.000 98.900 #MET(OL)
DIHE
X -NB-CU-X 1 0.000 180.000 3.000
X -CU-SH-X 1 0.000 180.000 3.000
X -CU-S -X 1 0.000 180.000 3.000
X -CT-SH-X 3 1.000 0.000 3.000
NONBON
CU 2.20 0.200
$AMBERHOME/exe/xleap -s -f $AMBERHOME/dat/leap/cmd/leaprc.ff99
> loadamberparams plc.frcmod
> loadoff 1PLC.lib
現在可以創建Prmtop and Inpcrd 文件;
> saveamberparm 1PLC 1PLC.prmtop 1PLC.inpcrd
用 ambpdb 創建pdb文件:
$AMBERHOME/exe/ambpdb -p 1PLC.prmtop < 1PLC.inpcrd > 1PLC.inpcrd.pdb
可以在VMD中觀察這個蛋白了。
We could now use these files to run plastocyanin simulations. You can try this yourself if you want. Just remember that this is in explicit solvent and a peridiodic box so you use periodic boundary conditions.
You will also need to minimise the system initially to remove bad contacts. I would then heat it over 20ps from 0 to 300K with constant volume periodic boundaries before moving to a long equilibration at 300 K
with constant pressure