10x Genomics RNA-seq 原理

 

下面的圖來自文章  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867415005498

 

Allon M. Klein, Linas Mazutis, Ilke Akartuna, Naren Tallapragada, Adrian Veres, Victor Li, Leonid Peshkin, David A. Weitz, Marc W. Kirschner

Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells

Cell, Volume 161, Issue 5, 21 May 2015, Pages 1187-1201

 

 

 

 圖一

 

 

圖二

 

首先，為了保證細胞在標記的過程中是分開的，發明了一個叫做微流體設備的東西（microfuidic device）
里面有三個上樣孔，在其中可以分別加入

1、樣本細胞懸液，

2、Gel Beads

3、partitioning oil。

像下圖中一樣。

 

 

 

然后，它就可以啟動圖二A中的流程，當細胞流過時，會被與beads結合然后被油滴包裹，形成一個油包水的密閉小液滴（droplet）。細胞和microparticle（beads）相遇會裂解，釋放出里面的各種物質，RNA（mRNA，tRNA，rRNA），蛋白質，脂質，DNA等等各種物質。因為beads上聯接了接頭，其中有一段是ploy （dT）序列（30）個，在細胞裂解釋放的核酸中，只有mRNA帶有polyA的尾巴，於是這段beads上面ploy （dT）就可以從眾多的裂解產物里捕獲到mRNA。這也就是Russell問我為什么Drop-seq要用3'端測序的原因了。
Maxter Mix中帶有反轉錄試劑，當mRNA被捕獲后，就可以從它的3‘端開始作為模板，進行反轉錄出cDNA的第一條鏈，這第一條鏈就沿着poly（dT）序列延申，長在了beads上，形成了圖二7中的STAMPs，接着我們把序列洗脫，以cDNA的第一條鏈為模板，進行PCR，合成cDNA的第二條鏈，然后就是我們熟悉的cDNA擴增，illumina測序。

 

我們如何知道那些序列是來自那個細胞的？或者說，single cell的RNA-seq和bulk的RNA-seq的最大區別在哪里呢？是Barcode，或者說是Cell barcode。每一個beads上都有着相同的Cell barcode，而beads與beads間的Cell barcode是不同的，假設每個beads只捕獲一個cell，那么則每個cell都被cell barcode 單獨標記了。
如何保證每一beads只捕獲一個cell呢？第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的數目遠遠超過cell的數目，即絕大多數的beads都是空的，只有少數的才捕獲到了cell。但是還是有個別的droplet里面會兩個或者更多的細胞，這就需要我們去QC啦。
single cell RNA-seq的barcode這么神奇，我們結合10x Genomics的說明書一起來分步驟詳解一下。

 

 

 

先來看看這些區段都是用來做什么的。
由內向外：
Poly（dT）：用來和polyA結合，捕獲mRNA
UMI：用來標記不同的PCR產物（數count）
10xBarcode：用來標記不同的細胞
Sample Index：用來標記不同的樣本
Truseq Read 1、2 ：用來進行連接beads，cDNA的PCR擴增和加P7接頭
P5和P7：用來進行illumina的橋式PCR測序。
在這些序列中，P5、P7、Read 1、2 的序列是已知的
和beads上連接的序列最開始只有Read1 ，10x Barcode，和poly（dT），其他的這些接頭是怎樣一步步加上，並且發揮作用的？10xGenomics的說明書上給了具體步驟。我看下來，覺得最主要的思想，就是用已知的序列設計引物，PCR出未知的序列。

 

 

利用Poly（dT）來捕獲mRNA，反轉錄出cDNA的第一條鏈，並且在cDNA的末端加上CCC序列，和TSO序列的GGG序列互補，並以TSO序列為模板，繼續延申。這其實很重要，因為中間cDNA的序列我們是不知道的，如果不加上這個接頭，就沒有辦法設計引物，合成cDNA的第二條鏈。

 

 

 對TSO序列和Read1 設計引物，合成cDNA的第二條鏈，並完成cDNA的擴增。

 

 

因為II代測序illumina測序不能測很長，約為200-700bp，所以不能測得mRNA全長，所以會把合成的cDNA利用酶打斷到illumina能測的長度，然后再兩邊加上接頭，Read2。 設計部分與Read1和Read2重疊的引物，加上P5，P7和sample index，就可以去進行illumina測序了。

 

 

 

鏈接：https://www.jianshu.com/p/70dcddd2084e