景傑生物 | 報道
乳酸 ( lactate ) 是細胞糖酵解途徑重要的含碳代謝產物，它的生物學功能得到了廣泛關注。在大腦中，乳酸在生理和病理條件下發揮不同的調控作用，如學習記憶和情緒調節。大腦中的乳酸已成為一種能量底物和有價值的信號分子，與20多種神經精神疾病有關。
乳酸化修飾 ( lactylation，Kla ) 是2019年芝加哥大學趙英明教授課題組在Nature雜志報道的全新蛋白質翻譯后修飾類型 [1]。后續研究進一步證實，蛋白質乳酸化修飾是乳酸發揮功能的重要方式，參與糖酵解相關細胞功能[2]、巨噬細胞極化[3]、腫瘤增殖調控[4]等重要生命活動。然而，尚不清楚賴氨酸乳酸化是否發生在腦細胞中？乳酸是否通過乳酸化修飾參與神經系統調控？
近日，生物預印本bioRxiv上傳了日本藤田醫科大學的科學家題為“Protein lactylation induced by neural excitation的研究論文。該研究發現神經興奮可引起大腦蛋白質發生乳酸化修飾，並揭示了腦細胞中賴氨酸乳酸化受乳酸水平、神經興奮和行為相關刺激的系統性變化的調節。這項研究為探索腦內蛋白質乳酸化介導的神經元活動的新作用開辟了一條途徑。景傑生物為該項研究提供了高特異性乳酸化修飾泛抗體（PTM-1401)。
1、乳酸處理增加大腦中的蛋白質乳酸化修飾
通過Western Blot分析研究人員在小鼠腦組織中檢測到Kla，並觀察到Kla信號存在整個神經細胞，包括細胞體和突起。在原代培養的神經元中，神經元細胞核區域的信號相對較弱（圖1a,b)。乳酸化修飾是否是由伴隨乳酸水平變化的刺激物誘導的？研究者進一步發現，乳酸處理顯著增加原代培養神經元中的Kla免疫反應性（圖1c，d)。使用4-CIN和MCT2抑制劑阻止乳酸轉運到神經元，Kla的增加被抑制（圖1d)。此外，乳酸處理還增加了小鼠前額葉皮質（PFC）的Kla免疫反應性（圖1f–h)，但在海馬體中沒有增加，提示外源性乳酸以區域依賴的方式刺激大腦中的蛋白質乳酸化。蛋白質乳酸化普遍發生在大腦的神經細胞中，包括谷氨酸能神經元、GABA能神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞（圖1i)。
圖1
2、神經元興奮刺激大腦中的蛋白質乳酸化
研究發現神經元興奮增加大腦乳酸水平，研究者通過體外神經元興奮模型（用高濃度鉀離子（高鉀）處理原代神經元，誘導體外神經元去極化，圖2a)，分析神經元興奮與乳酸和蛋白質乳酸化水平。研究發現，高鉀處理后30分鍾，培養上清中乳酸濃度最高，而細胞中乳酸水平呈時間依賴性增加趨勢，高鉀處理開始后2小時達到峰值（圖2b)。乳酸脫氫酶(LDH)抑制劑——草氨酸鈉（OX）可抑制丙酮酸還原為乳酸，OX處理后高鉀誘導的Kla水平減弱（圖2c)，這表明神經元興奮可能通過細胞內代謝和糖酵解途徑誘導蛋白乳酸化。
通過電休克刺激（ECS）小鼠進行體內實驗驗證，研究發現腦中乳酸水平、和Kla免疫反應強度在ECS后10分鍾升高並持續1小時（圖2d，e)。使用抑制劑OX和4-CIN聯合處理，Kla水平減弱（圖2f,g，h)，表明在體內，細胞內新乳酸的產生和細胞外乳酸的攝取在神經元活化誘導的蛋白乳酸化中都起作用。在ECS小鼠模型中，Kla免疫反應強度與神經活性標記物c-Fos在單個細胞水平上呈顯著正相關，激活的神經元越多，細胞中誘導的Kla越多（圖2i，j)。
圖2
3、SDS抑郁模型中大腦的蛋白質乳酸化
為了檢驗大腦乳酸和Kla水平與焦慮和抑郁行為之間的相關性，研究者們構建了社會挫敗應激（SDS）抑郁模型，使用單次SDS應激抑郁和連續10天的抑郁慢性實驗，來檢測小鼠前額葉皮質中神經活性標記物c-Fos、乳酸、Kla的變化。研究發現SDS抑郁小鼠前額葉皮質中c-Fos、乳酸、Kla都顯著上升，OX處理的單次SDS應激致郁小鼠乳酸水平降低，但OX處理9天后的抑郁小鼠其腦中乳酸水平與Kla水平矛盾性的增加（ 圖3c )。簡單相關和多元回歸分析表明腦乳酸水平的增加與焦慮行為相關（ 圖3d )，在接受更多焦慮刺激的小鼠中發現Kla水平與PFC中的c-Fos表達水平正相關（ 圖3i )。表明小鼠對SDS越敏感，焦慮程度越高，PFC中Kla水平越高。
圖3
4、腦PFC組織中乳酸化蛋白的鑒定
最后，研究者們利用Kla抗體免疫沉淀和質譜技術（質譜策略）分析了抑郁小鼠和對照小鼠的PFC（樣本策略），鑒定到小鼠PFC中63種候選的賴氨酸乳酸化蛋白。GO富集分析表明這些蛋白質主要富集在核小體和組蛋白相關的生物過程中。其中12個蛋白在SDS抑郁刺激中發生顯著變化，包括7個上調蛋白，5個下調蛋白。值得注意的是，12個改變的蛋白質中包括組蛋白H1的4個亞型，並且都被上調，這表明SDS增加了組蛋白H1的乳酸化。進一步用組蛋白H1抗體進行免疫沉淀，然后用Kla抗體進行Western Blot印跡分析。結果表明在PFC中，59.5%的細胞的組蛋白H1陽性，幾乎所有組蛋白H1陽性細胞（94.6%）為Kla陽性（圖4a，b)。顯微鏡超分辨率成像觀察到細胞核中的組蛋白H1和Kla雙陽性結構，提示組蛋白H1處存在賴氨酸乳酸化（圖4c)。與對照組小鼠相比，抑郁小鼠細胞核中的雙陽性結構增加（圖4d)，進一步支持SDS處理增強PFC中組蛋白H1的賴氨酸乳酸化水平。
圖4
總而言之，這項研究首次對大腦和神經元細胞中的乳酸化水平進行系統分析，為探索大腦中的蛋白質乳酸化是否與神經精神疾病的病因和病理生理學的提供了指引方向。結果表明賴氨酸乳酸化廣泛存在大腦中，並受神經元活動的調節。抑郁小鼠中神經活性標記物c-Fos、乳酸、Kla都顯著上升，表明抑郁情緒與神經興奮引起的大腦蛋白質乳酸化有關。研究進一步在大腦PFC組織中鑒定到63種候選的乳酸化蛋白，為下一步揭示乳酸化修飾在細胞和行為水平上對每種蛋白質發揮功能提供了數據。
參考文獻1. Zhang, D. et al. 2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature.2. Linpeng Li, et al. 2020. Glis1 facilitates induction of pluripotency via an epigenome–metabolome–epigenome signalling cascade. Nature Metabolism.3. Ricardo A. Irizarry-Caro, et al. 2020. TLR signaling adapter BCAP regulates inflammatory to reparatory macrophage transition by promoting histone lactylation. PNAS.4. Jie Yu, et al. 2021. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biology.5. Hideo Hagihara1, et al. 2021. Protein lactylation induced by neural excitation. bioRxiv.