近年來，組蛋白翻譯后修飾（PTMs）因其能夠通過改變染色質結構進而調控基因轉錄和表達，在惡性轉化、腫瘤發生和進展中發揮重要作用 [1 ]，已成為表觀遺傳研究熱點之一。目前發表的研究報道已鑒定到乳酸化、苯甲酰化、巴豆酰化等多種組蛋白翻譯后修飾類型，並對其開展了深入研究，極大的拓展了我們對表觀遺傳學的認知。對於其它未被發現的組蛋白翻譯后修飾類型的探索仍在進行中。
2021年9月20日，北京大學基礎醫學院、國際癌症研究院張宏權教授團隊在Nature Communications雜志發表了題為“Isonicotinylation is a histone mark induced by the anti-tuberculosis first-line drug isoniazid”的文章，首次發現了組蛋白異煙酰化修飾 (Isonicotinylation) 這種新型的蛋白質翻譯后修飾類型，並對調控該修飾的酶系統及生物學功能進行了研究。
研究人員首次報道異煙肼 (Isoniazid，INH) 及其代謝產物誘導組蛋白發生翻譯后修飾——賴氨酸異煙酰化(Kinic)，進一步研究發現Kinic修飾由CBP和P300(乙酰轉移酶)以及HDAC3(去乙酰化酶)動態調控，INH介導的組蛋白Kinic上調PIK3R1表達並激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進肝細胞癌（HCC）的發生發展。景傑生物作為合作單位參與此次研究，並為該研究提供抗體開發與蛋白組學技術支持。
01INH刺激細胞和小鼠的組蛋白賴氨酸異煙酰化
研究人員對INH刺激的HepG2細胞富集蛋白進行HPLC-MS/MS檢測並利用PTMap軟件進行分析，發現其存在賴氨酸異煙酰化的翻譯后修飾，並進一步運用開發的高特異性抗體（anti-Kinic，景傑生物），證實這種修飾在15種真核細胞類型中廣泛存在。由於酰基化通常由脂肪酸代謝物調節，研究人員試圖確定Kinic的上游誘導因素，結果表明，INH及其下游代謝產物異煙酸或異煙酸鈉均能誘導細胞內組蛋白或非組蛋白Kinic (下圖b-d) 。INH處理后，小鼠肝臟組織中的組蛋白和非組蛋白Kinic水平均增加 (下圖f) 。
圖、INH誘導組蛋白賴氨酸發生異煙酰化
02INH是細胞內異煙鹼輔酶A的供體
為進一步確認INH誘導的Kinic是由INH直接引起還是由其代謝產物異煙酸（INA）引起，ABT、APAP（兩種N-乙酰基轉移酶抑制劑）和BNPP（異煙肼水解酶抑制劑）被用來阻斷細胞內INH代謝，結果表明INH可以直接誘導組蛋白Kinic，而無需將INH轉化為INA (下圖g) 。
Acetyl-CoA是賴氨酸乙酰化反應的輔助因子，那么類似的，是否Inic-CoA是細胞內Kinic反應的輔因子？為了驗證這一猜想，研究人員用質譜法對同位素D4-INH標記的HepG2細胞進行定量，結果表明，D4-Inc-CoA在D4-INH處理后明顯增加 (下圖h，右)，而Ac-CoA作為對照則沒有變化 (下圖h，左)。並且，HPLC-MS/MS結果顯示INH處理劑量依賴性地引起Inic-CoA的細胞濃度升高 (下圖i)。以上數據表明，Inic-CoA在活細胞中存在，並證明了組蛋白標記Kinic是由INH刺激產生Inic-CoA引發的。
圖、INH是細胞內異煙鹼輔酶A的供體
03CBP/P300和HDAC3分別作為異煙酰基轉移酶和去異煙酰基酶
為了尋找組蛋白異煙酰基轉移酶，研究人員過表達四種組蛋白乙酰基轉移酶，結果發現組蛋白被CBP和P300明顯異煙酰化，但PCAF和hMOF誘導的異煙酰化水平較低 (下圖a)。過表達CBP和P300會導致HepG2和HeLa細胞內組蛋白異煙酰化和乙酰化水平升高 (下圖b)。siRNA干擾或用A-485/ SGC-CBP30（CBP/P30038抑制劑）抑制內源性CBP和P300表達，組蛋白異煙酰化和乙酰化水平降低。此外，體外實驗也表明，CBP/P300在體外能有效地使組蛋白異煙酰化 (下圖c)。
隨后，研究者用脫乙酰酶抑制劑處理HepG2細胞，可以觀察到TSA（HDAC家族脫乙酰酶抑制劑）處理組蛋白異煙酰化水平升高，而NAM（SIRT家族脫乙酰酶抑制劑）處理后無變化，表明HDAC家族成員影響組蛋白異煙酰化 (圖4d)。免疫熒光和WB結果顯示，HepG2細胞過表達HDAC3導致異煙酰化水平明顯降低（下圖e-f）。siRNA干擾內源性HDAC3，組蛋白異煙酰化和乙酰化水平升高，表明HDAC3是一種組蛋白去異煙酰化酶。綜上所述，CBP和P300是組蛋白異煙酰基轉移酶，去乙酰化酶HDAC3是組蛋白異煙酰基轉移酶。
圖、CBP/P300和HDAC3分別作為異煙酰基轉移酶和去異煙酰基酶
04組蛋白Kinic導致更高的染色質開放性，並促進基因轉錄
組蛋白酰化可以影響核小體結構和染色質開放性。研究者通過MNase敏感性試驗證明INH誘導的組蛋白Kinic導致核小體DNA對MNase處理的敏感性，從而提高了染色質開放性 (下圖a)。此外，Sat-2是異染色質結構改變的標志，當着絲粒區放松時，Sat-2基因的轉錄增加。Real-time RT-PCR結果顯示Sat-2基因表達上調，表明INH誘導的組蛋白Kinic導致異染色質松弛 (下圖b)。
研究者進一步對INH處理的HepG2細胞總RNA進行了RNA-seq，發現313個基因表達上調，而121個下調 (下圖c)。KEGG通路富集分析顯示，上調基因主要與TNF信號通路、造血細胞譜系、補體和凝血級聯、GABAergic突觸和cAMP信號通路相關 (下圖d)。這些發現表明組蛋白Kinic，像其他酰基化一樣，通過松動基因組中的染色質結構來促進基因轉錄。
圖、Kinic影響染色質開放性和基因轉錄水平
05INH誘導的組蛋白Kinic與癌症發生相關
INH是一種一線抗結核葯物，但具有顯著肝毒性，能夠誘發肝衰竭及大鼠肝癌 [ 2 ]。為闡釋其副作用產生機制，研究人員收集了10種不同類型的腫瘤組織和鄰近正常組織進行免疫組化染色來確定組織中的Kinic水平。結果表明，胃癌組織的總Kinic水平低於正常組織，而肺腺癌和甲狀腺癌組織的總Kinic水平高於正常組織 (下圖a-b)。這些發現表明，Kinic水平可能與多種類型的癌症有關。結果顯示，在INH刺激下，PIK3R1的mRNA和蛋白水平顯著升高。值得注意的是，p-Akt和p-mTOR的表達水平也明顯升高，表明mTOR信號通路被組蛋白Kinic激活 (下圖c-d)。RNA-seq結果分析發現組蛋白Kinic可促進PI3K/Akt/mTOR通路多個基因的表達，包括FLT3LG、IL7、PIK3R和CHRM1(下圖e)。這一發現表明，INH誘導的組蛋白Kinic激活了PI3K/Akt/mTOR信號通路，這可能是組蛋白Kinic與癌症發展相關的證據。
圖、組蛋白Kinic與癌症發展相關
總之，本文首次報道了組蛋白異煙酰化修飾Kinic，並進一步報道Kinic的調控酶：CBP/P300 (乙酰轉移酶) 以及HDAC3 (去乙酰化酶) 動態調控Kinic修飾水平。Kinic改變組蛋白染色質結構，影響PIK3R1表達與PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，從而促進癌症的發生與發展。新報道的組蛋白異煙酰化修飾豐富了組蛋白翻譯后修飾的內容，也為異煙肼治療所導致的多種毒副作用和致癌風險機制的闡明提供了新的科學依據。
北京大學基礎醫學院博士研究生蔣瑀涵為本文的第一作者，北京大學基礎醫學院、國際癌症研究院張宏權教授為通訊作者。研究過程中得到了北京大學基礎醫學院病原生物學系陳香梅副教授、杭州景傑生物科技股份有限公司程仲毅博士和翁葉靖博士的幫助。該研究受國家自然科學基金委員會重點項目、科技部重大基礎研究專項、北京市自然科學基金重點項目及北京大學重點基礎研究專項的支持。
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參考文獻：
[1] Tan, M., et al., 2011, Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell.
[2] Li, F., et al., 2016, A High Dose of Isoniazid Disturbs Endobiotic Homeostasis in Mouse Liver. Drug Metab Dispos.
[3] Yuhan Jiang, et al., 2021, Isonicotinylation is a histone mark induced by the anti-tuberculosis first-line drug isoniazid. Nature Communications.
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