原文標題：A tutorial on conducting genome-wide association studies: Quality control and statistical analysis
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29484742/
2 | 軟件
質量控制流程和統計分析將使用免費的、開源的全基因組管理分析工具集PLINK 1.07版（Purcell等人，2007）進行說明，該工具集可以從 http://zzz.bwh.harward.edu/plink 下載。PLINK 1.9測試版包含相同的選項，同時運行的速度要快得多 https://www.cog-genomics.org/plink/1.9/ 。由於PLINK 1.9目前是測試版本，我們在本教程中使用了官方版本的PLINK。但是，也可以使用PLINK 1.9完成教程的所有內容。盡管本文中討論的某些步驟可以在R等傳統統計軟件包中執行，但專門用於分析遺傳數據的軟件包使用起來要方便得多。除了PLINK，還有許多其他不錯的選擇可用於分析SNP數據，例如Genebel（Aulchenko等人，2007）和 SNPTEST（Marchini等人，2007）。 此外，允許在基於家庭的GWAS中測試關聯的方法的軟件也被開發出來了（Chen和Yang，2010，Ott等）。我們建議使用基於GNU/Linux的計算機環境，盡管許多選項也可以通過Windows版本的PLINK獲得。可以在 http://www.ee.surrey.ac/Teaching/Unix 上找到shell和命令行的基本介紹。Github上的示例腳本生成的所有圖形都將使用免費的開源編程語言R（ https://www.r-project.org/ ）獲得。
2.1 | 數據格式
PLINK可以讀取文本格式的文件，也可以讀取二進制格式的文件。由於讀取大型的文本文件可能耗費大量的時間，於是我們推薦使用二進制格式的文件。文本形式的PLINK數據由兩個文件組成：一個包含了個體及其基因型的信息（*.ped），另一個包含了遺傳標記信息（*.map；詳情見圖1）。相應的，二進制形式的PLINK數據由三個文件組成，其中一個二進制文件包含了個體的標識符（IDs）和基因型（*.bed），另兩個文本文件各自包含了個體信息（*.fam）和遺傳標記信息（*.bim，詳情見圖1）。例如，在雙向情感障礙的研究中，*.bed文件包含了所有患者和健康對照的基因分型結果；*.fam文件包含了與受試者相關的數據（與研究中其他參與者的家庭關系、性別和臨床診斷）；而*.bim文件包含了有關SNP物理位置的信息。使用協變量（covariates）的分析通常需要第四個文件，其中包含了每個人的相關協變量的值（參見圖1）。
圖1 各種常用的PLINK文件。SNP即單核苷酸多態性
2.2 | PLINK基礎命令
PLINK是一款命令行程序，因此，使用PLINK需要一個活動的shell來等待命令。這可以通過光標前的提示（$或者>）來識別。通常情況下，當前目錄的路徑會顯示在提示符之前，如圖2所示。當前目錄是PLINK使用中的一個核心概念，因為在默認情況下，PLINK將從當前目錄加載數據文件，並將運行產生的結果文件保存在當前目錄中。當前目錄可以通過傳統的Unix命令（通常是cd）來改變為任何目錄。在提示之后，通過輸入plink關鍵字表示我們需要使用PLINK。如果PLINK沒有安裝在標准目錄中，則必須在命令前面加上PLINK的安裝目錄路徑，例如，/usr/local/bin/plink。
在輸入的plink關鍵字之后，控制PLINK的工作流程的其他選項將緊隨其后，並以空格分隔。這些選項全都以兩個橫線（--）開頭。需要提供的第一個選項之一是數據文件的格式和名稱：對於文本文件，使用--file {your_file}，二進制文件則使用--bfile {your_file}。之后，可以添加所有其他必須的選項，例如，--assoc選項表示執行關聯分析，如圖2所示；此選項將告訴PLINK為每個SNP對感興趣的表型執行\(X^{2}\)測試。可以在單個命令行中結合使用多個選項。在PLINK中已經對命令選項實現了默認的順序，無論執行的命令行中的命令順序如何，它都能正常工作。一個有用的、有時也是強制性的選項是--out {outfile}，它為PLINK提供了輸出文件的名稱（PLINK會根據需要添加文件后綴名）。請注意，PLINK會在靜默狀態下（不通知用戶）刪除任何與之同名的現有文件（所以要注意當前文件夾下的現有文件是否存在沖突）。請注意，PLINK中的命令選項超出了本文所討論的范圍；關於全部的可用選項，請參見 http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/ 。
圖2 PLINK命令行的結構。*並非所有shell都像這樣顯示。**如果PLINK不在當前目錄中，請提供安裝PLINK的目錄的路徑（例如，\usr\local\bin\plink）。請注意，此示例命令是使用Putty（一個免費的SSH和Telnet客戶端）生成的。使用其他資源（ssh連接軟件或者終端軟件）進行操作時，可能在圖形界面上有略微的變化；但是，PLINK命令的基本結構將是相同的。
3 | 基因（遺傳？）數據的質量控制
任何GWAS中都應該存在的一個重要的步驟就是使用適當的質量控制（Quality Control），如果沒有廣泛的質量控制，GWAS產生的結果將不會是可靠的，因為原始的基因型數據本質上是不完美的。數據中的錯誤可能有多種原因，例如，由於DNA樣本的質量很差、DNA與芯片（array）的雜交效果不佳、基因型探針性能不佳以及樣本的混淆或污染（contamination）。例如，因為未能徹底控制這些數據上的問題，導致Sebastiani等人發表的一篇文章被撤回(2010) in Science (Sebastiani 等人, 2010, 2011; Sebastiani等人, 2012; Sebastiani等人, 2013)。被撤回的文章的結果受到了Illumina 610芯片技術錯誤和質量控制不足的影響。盡管經過適當的質量控制后，（文章中的）主要科學發現仍然能得到足夠的支持，但新的分析得到的結果偏差很大，以至於作者決定撤回該文章。
3.1 | 使用HapMap數據進行數據模擬
為了能夠使用真實的遺傳數據說明所有分析步驟，我們使用了來自國際HapMap項目（http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/downloads/genotypes/2010-05_phaseIII/plink_format/ ；Gibbs 等人，2003 年）的公開數據模擬了一個數據集（N=207），其中包含了二進制形式的結果度量。在本教程中，為了創建種族同質的數據集，（在數據集中）我們只包括了來自北歐和西歐（CEU）血統的猶他州（Utah）居民。由於HapMap數據的樣本量相對較小，這些模擬中的遺傳效應大小設置為比通常在復雜性狀遺傳研究中觀察到的值要大。需要注意到的是，檢測復雜性狀的遺傳風險因素需要更大的樣本量（例如，至少在數千，甚至可能是數萬或數十萬）。可以在 https://github.com/MareesAT/GWA_tutorial/ (1_QC_GWAS.zip) 找到具有模擬表型特征的 HapMap 數據。
3.2 | 質量控制步驟概述
由於GWAS所面臨的挑戰，我們旨在說明基本的質量控制步驟並提供示例的腳本。表1總結了七個質量控制的步驟，並包括有關特定閥值的建議。但是，閥值可能會根據研究的具體特征而有所不同。七個質量控制的步驟根據以下的內容來過濾掉SNP和個體：(1)個體和SNP缺失，(2)受試者的分配和遺傳性別不一致（見性別差異，sex discrepancy），(3)次要等位基因頻率（MAP，minor allele frequency），(4)與哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium， HWE）的偏差，(5)雜合率，(6)相關性，以及(7)種族異常值（見種群分層，population stratification）。
通過遵循我們的在線教程（https://github.com/MareesAT/GWA_tutorial/ 上的1_QC_GWAS.zip + 2_Population_stratification.zip）中概述的所有步驟，可以獲得有關質量控制步驟1-7性能表現的實踐經驗。教程中提供了用於數據質量控制和潛在偏差來源可視化的腳本。這些腳本對HapMap數據的CEU組執行了質量控制，可以應用於其他數據集，不過基於家庭的數據集和涉及多個不同種族的數據集除外。通常來說，如果樣本包括多個種族（例如，非洲人、亞洲人和歐洲人），建議分別對每個種族進行關聯測試並使用適當的方法，例如meta分析（Willer等人，2010），來將結果結合起來。如果您的樣本中包括來自單一族群的受試者，則可以通過以下討論的方法來校正剩余的種群分層。
表1 在遺傳關聯分析之前應進行的七個質量控制步驟
| 步驟 | 命令 | 功能 | 閾值和相關解釋 |
|---|---|---|---|
| 1:個體和SNP缺失 | (1)--geno(2) --mind |
(1)排除大部分受試者中缺失的SNP。在這一步中，刪除具有低基因型調用（low genotype calls）的SNP。 (2)排除基因型缺失率高的個體。在此步驟中，刪除具有低基因型調用的個體。 |
我們建議首先根據寬松的閾值(0.2;>20%)過濾SNP和個體，因為這將過濾掉SNP和具有非常高水平缺失的個體。然后可以應用具有更嚴格閾值的過濾器(0.02)。 注意，SNP過濾應該在個體過濾之前進行。 |
| 2:性別差異 | -check-sex |
根據X染色體雜合率/純合率檢查數據集中，記錄的個體的性別與其性別之間的差異。 | 可以揭示樣品混淆。如果許多受試者都有這種差異，則應仔細檢查數據。男性的X染色體純合度估計值應大於0.8，而女性的值應小於0.2。 |
| 3:次要等位基因頻率（MAF） | --maf |
僅包括高於設定的MAF閾值的SNP。 | 具有低MAF的SNP很少見，因此缺乏檢測SNP表型關聯的能力。 這些SNP也更容易出現基因分型錯誤。 MAF閾值應取決於您的樣本大小，較大的樣本可以使用較低的MAF閾值。 對於大樣本（N=100,000）與中等樣本（N=10000），通常使用0.01和0.05作為MAF閾值。 |
| 4:哈代-溫伯格平衡（HWE） | --hwe |
排除偏離哈代-溫伯格平衡的標記。 | 基因分型錯誤的常見指標，也可能表明進化選擇。 對於二元性狀，我們建議的用於排除的閾值：在cases中的HWE p值小於1e-10和在controls中p值小於1e-6。不太嚴格的case閾值可避免在選擇時丟棄與疾病相關的SNP（參見我們的在線教程）。 對於數量性狀，我們建議HWE的p值小於1e-6。 |
| 5:雜合率 | 見在線教程中的示例腳本 | 排除雜合率較高或較低的個體。 | （雜合率的）偏差（deviation）可以揭示樣品污染和近親繁殖的存在。 我們建議刪除偏離樣本雜合率平均值±3 SD的個體。 |
| 6:相關性 | (1)--genome(2) --min |
(1)計算所有樣本對的IBD（identity of descent）。 (2)設置閾值，並創建相關性高於所選閾值的個體列表。這意味着可以檢測到相關對象（個體），例如pi-hat>0.2（即二級親屬，second degree relatives） |
在此分析中使用獨立的SNP（修剪，pruning）並將其限制為僅常染色體。 隱藏的相關性會干擾關聯分析。如果您有一個基於家庭的樣本（例如，父母-后代），則不需要刪除相關對，但統計分析應考慮家庭相關性。然而，對於基於種群的樣本，我們建議使用0.2的pi-hat閾值，這與文獻中提到的一致（Anderson 等人，2010 年；Guo 等人，2014 年）。 |
| 7:種群分層 | (1)--genome(2) --cluster --mds-plot k |
(1)計算所有樣本對的IBD（identity of descent）。 (2)基於IBS生成數據中任何子結構的k維表示。 |
在此分析中使用獨立的SNP（修剪，pruning）並將其限制為僅常染色體。 K是維數，需要定義（通常是10）。這是有多個程序組成的質量控制中的重要步驟，但出於完整性考慮，我們在表中簡要地提及此步驟。此步驟將在“控制種群分層”一節中更詳細地描述。 |