這期推文的封面是一張富集分析的網絡圖，來自文獻：Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations，算是比較新穎的富集展示方法，是用Cytoscape做的。
之前我介紹過一個網頁工具，可以做富集結果的網絡圖，這篇推文的閱讀量已經是我的小破公眾號關注人數的兩倍多，可以看出大家對這個很感興趣。這一期，我繼續介紹這種網絡圖，用到的是Cytoscape，比之前的網頁工具可定制程度更高。主要參考的protocol來自文獻：Pathway enrichment analysis and visualization of omics data using g:Profiler, GSEA, Cytoscape and EnrichmentMap。
公眾號后台回復20210401獲取這篇protocol，以及測試數據。
這篇文獻除了寫富集可視化，還寫了如何做富集分析、GSEA，考慮相當周到，通讀全文可以發現不少知識點，滿滿都是干貨，比如
- 做GSEA時，不需要對基因做過濾
- Biological process是最常用的GO注釋
- 做GSEA時，需要對基因排序，排序的標准可以是一個或多個指標的結合，比如log-transformed fold-change，−log10 P value multiplied by the sign of log-transformed fold-change
- 將冗余的通路合並到單個生物主題能簡化后續的解釋。這種網路圖就是這個目的，每一個通路是一個圓點，兩個通路之間共享很多基因的話會用線連起來，共享基因數目越多，線越粗
...
什么是Cytoscape？
Cytoscape是一個開源軟件平台，主要用於分子互作網絡和生物通路的可視化，以及將這些網絡與注釋信息，基因表達譜整合起來。 盡管Cytoscape最初是為生物學研究而設計的，但現在它是進行復雜網絡分析和可視化的通用平台。
當我打開官網的時候，我驚呆了，真的太好看了！
這篇protocol中，對於整個基因富集過程分了三步
- 使用組學數據定義目標基因列表
- 通路富集分析：過濾后的基因集（比如找差異基因，就是要過濾的，工具 g:Profiler，當然我們都很熟的clusterProfiler也是可以的）；不過濾要排序的基因集（比如做GSEA）。這一步之后就能得到富集到的通路以及對應的顯著性
- 通路富集分析結果的可視化和解釋
我主要演示最后一步，只要兩個文件：
一個包含富集結果的文件；
一個是在做富集時，用到的參考文件，比如GO BP文件，gmt格式
電腦要求8G內存
1 GB of RAM is sufficient to run GSEA
analysis; however, Cytoscape (required to run EnrichmentMap software) requires ≥8 GB of RAM.
軟件及插件安裝
下載地址：https://cytoscape.org/download.html
cytoscape的安裝很容易
安裝4個插件：
EnrichmentMap, v.3.1 or higher; clusterMaker2, v.0.9.5 or higher; WordCloud, v.3.1.0 or higher; AutoAnnotate, v,1.2.0 or higher.
打開Cytoscape點擊上方的APP菜單欄，Apps → App Manager，在新窗口搜索這四個插件，找到后點擊這個插件，然后點擊右下角的"Install"即可安裝。可以在新窗口的"Currently Installed"菜單查看是否已經安裝成功。
演示
文獻原文同時介紹了GSEA富集的網絡圖，步驟基本一樣。另一方面，做GSEA一般會挑基因集去做，基因集不會很多，這種網絡圖可能還沒有GSEA經典圖用得多。所以我用找差異基因過濾后的基因集做演示。
打開軟件之后，首先打開EnrichmentMap，按照圖示箭頭依次輸入
新窗口按照圖示導入需要的文件和參數
注意在表型這一欄，我填入了兩個相反的表型，文獻提供的GO富集結果只有一種表型，因此可以不填。
點擊build，可以得到如下結果，
整體上看，框架已經有了，接下來做一些調整
鼠標點擊圖中的每一個節點，選中的節點會變為黃色，這時我們可以隨意拖拽節點到新的位置。在按住"Ctrl"鍵的同時，鼠標左鍵畫矩形，可以同時選中多個節點和多個連邊，這時可以一起拖拽。
最左邊的是EnrichmentMap插件的控制窗口，Node Cutoff調整p值，越嚴格，圖形中剩下的節點越少；Edge Cutoff可以調整節點之間是否顯示連線，值越大，則更相似的節點才會連線。
接下來，我們將兩種表型分開，一個放左邊，一個放右邊，盡管我這個圖左右分得比較好，手動拖拽節點，幾下也能分開，但不排除會遇到兩種表型的通路分不太開的情況。
我們首先需要點擊最左側的"Filter"菜單，然后點擊"+"號，選擇"Column filter"，
選擇這個NES開頭的選項
我們在最開始設置表型時，positive設置為處理組，軟件會把處理組的NES都設為1，對照組設為-1。在新窗口將范圍調為0到1，這里的0-1選擇的就是處理組；-1到0是未處理組。
選中的節點都變成了黃色，拖動它們至左邊位置。
接下來對這些選中的節點，重新排布
處理組節點新的布局不一定合適，有時候還是需要手動調整節點的位置，所以重新排布這一步也不是必須的，Ctrl+z可以撤銷操作。
之后我們把過濾范圍設為-1到0，對照組做同樣的調整，
我們從上圖可知一些共享較多基因的通路會聚在一起，它們往往功能也比較相似。接下來我們用AutoAnnotate插件將cluster畫圈以及總結出cluster的大致功能（這一步是根據通路名稱的詞頻得出的）。
在新窗口點擊開始即可
新的圖形是這樣的，同時右上角出現的新面板可以調整圖中的橢圓外形。
多數情況下，這些cluster的名稱需要人工矯正。如下圖，點擊名稱后，鼠標右鍵：
另一方面，每個圓圈內的通路名稱，也可以去掉
在EnrichmentMap的控制窗口點擊"Publication ready"
圖示圓圈比較密集，我們可以調整左下角Layout Tools的scale這一條
新的圖是這樣的
進一步做一些微調，
接下來就可以保存文件了
如下，保存為pdf
當然也可以另存為cytoscape(cys)文件，方便下次接着繪制
好啦，這篇推文就到這里。整理不易，若這篇推文對您有所幫助，歡迎轉發，謝謝！
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