基於二代測序的RNA癌症研究方法
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基於DNA層面的癌症研究：一本字典
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基於RNA的癌症研究：從字典種挑取寫一篇日記
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RNA特點：
時空特異性：需要控制變量對照組
協同作用，形式多樣：表達量高低/可變剪接/單鹼基突變/融合基因，mRNA/lncRNA/miRNA/ceRNA...
可控可逆，“溫和”調節：治療前后，短期發展進程 -
在設置對照組應盡量保證無環境或其他因素的干擾：如取同患者腫瘤與其癌旁組織；葯物處理時選擇同窩小鼠
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重復性設置，排除隨機波動
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基因定量：FPKM/RPKM/TPM
定量方法
比對到參考轉錄組：RSEM，eXpress
比對到參考基因組：cutdiff/cutffquant，HTseq
不需比對（mapping free）：Sailfish，Kallisto，速度快 -
差異表達：foldchange，pvalue
DESeq2等
不夠生物重復樣本，NOISeq
一般數目控制在百級別 -
功能數據庫：GO/KEGG（適合genelist）
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疾病相關數據庫：OMIM/PharmGKB/GeneCards/COSMIC（適合單基因檢索）
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可變剪接：轉錄后調控形式（一個基因轉錄后選擇不同外顯子區域進行連接組合，形成不同的轉錄本亞型，並翻譯成蛋白），哺乳動物尤為常見，人95%的多外顯子基因都可能存在
可變剪接影響：蛋白功能/活性/作用位置
癌症研究中，可變剪接結果不易理解和驗證，不建議做結構研究（適合三代），因此優先級靠后 -
可變剪接研究方法
基於轉錄本亞型定量：同一基因不同可變剪接亞型的比例，Cutffdiff/rSeqDiff/RSEM
基於單個可變剪接事件（更常見，研究是否發生可變剪接現象）：外顯子跳躍，內含子保留等單個事件，rMATS/DiffSplice -
用轉錄組數據call SNP
優勢：更容易發現與功能相關的SNP
挑戰：基因表達豐度不同，覆蓋度極不均勻；可變剪接的存在給外顯子邊緣SNP鑒定帶來困難；RNA編輯干擾SNP鑒定
流程：clean reads——HISAT比對——GATK call SNP——SNP過濾 -
融合基因
癌症中特異的存在，因基因組上的倒位、易位、插入、缺失等大型結構變異造成。原本在染色體上距離較遠，或者不在同一染色體上的基因距離接近，並一同轉錄形成融合轉錄本的現象。
變異罕見，一般只出現在癌症/腫瘤組織中，是一種理想的biomarker。
癌症中的融合基因：BCR-Abl（22chr——9Chr），Imatinib。白血病患者biomarker和葯靶
融合基因的鑒定結果（少且易讀）：哪些基因進行了融合，融合位置，reads支持數。易驗證（設計PCR引物測序）
基於長讀長測序的轉錄本結構研究
- 轉錄本長度一般1k-5k，二代平台（100-150bp）覆蓋不了整條。基於短讀長RNA-seq組裝產生大量的嵌合體
- PacBIo讀長10-40k，更利於研究可變剪接和轉錄本結構變異
- 基於長讀長的融合基因研究
二代測序只能確定有融合事件發生，獲得融合位置一小段區域，三代可獲取完整融合轉錄本序列和融合亞型
單細胞RNA-seq的癌症應用
- 常規RNA：組織——組織勻漿，RNA提取（平均化異質性）——測序
- 低通量，高深度單細胞技術：組織——挑選單細胞（流式細胞儀等）——單管單細胞（SMART-seq2），有偏的人為挑選，每個細胞單獨建庫，高深度，每個細胞能鑒定1-1.2萬基因
- 高通量，低深度單細胞技術：組織——海量單細胞文庫（基於微流控系統，10X Genomics/MGI DNBelab C4/BioRad），一次捕獲1000-10000個細胞，每個細胞鑒定300-3000個基因，無偏
- 單管單細胞適合個體研究，針對同質性群體；高通量單細胞適合群體研究，針對異質性群體
- 高通量單細胞：細胞分群——marker gene（只在這類細胞中表達/高表達）
- 空間單細胞轉錄組：多一維位置信息，如針對腫瘤位置相關的研究，皮膚癌/實體瘤，尚不成熟
腫瘤基因組臨床應用專題：
【1】 腫瘤醫學研究前言進展
【2】腫瘤基因檢測相關技術原理
【3】腫瘤基因組數據分析方法概述
【4】腫瘤轉錄組測序分析流程及相關軟件
【5】腫瘤DNA甲基化數據分析原理及流程
【6】腫瘤胚系突變遺傳分析及數據庫使用
【7】基於NGS檢測體系變異解讀和數據庫介紹
【8】腫瘤臨床遺傳咨詢及案例分析