1、原理(馬達蛋白 納米孔蛋白 電阻膜)
1.1 馬達蛋白牽引DNA/RNA 與納米孔蛋白結合,因為薄膜兩端電勢差導致解鏈后的鏈可以通過納米孔。而通納米孔的鹼基因為結構和帶電的不同產生的電阻不同,導致電信號不同。最后通過basecalling的方法對原始的電信號解讀獲得鹼基。
1.2 通過不同的文庫制備方案來控制片段長度(M級別)
1.3 納米孔的升級:從R6(2014)到目前的R10芯片,從准確度 、長度、通量方面得到改善。目前多數還在用R9.4(2016).
R10 的納米孔有兩對reader heads,提高同聚物區域的准確度
flip-flop鹼基識別算法提升了R9共有序列一致准確信-從新識別現有數據可達到Q37(99.98%)
1.4 建庫方法:
1D 建庫:高分子量DNA提取、片段選擇、損傷修復和末端制備、連接測序測序接頭(加barcode)
1D2建庫:可以測兩條鏈;高分子量DNA提取、片段選擇、損傷修復和末端制備、1D2接頭、鏈接測序接頭、連接系鏈蛋白(輔助另外一條鏈的隨后測序,並且並且可以相互校正);單read 的准確度在97%,但是目前的雙鏈配對率偏低,捕獲信息較少,會降低有效數據量,數據損失在50%左右。
2D建庫:類似於pb的環形蛋白,已丟棄
1.5 測序平台
minlon gridlon promethlon(P24 *100 || P48 *100 ) flongle(小的測序平台)
minlin/gridlon 的芯片通道數目512 ;promethlon 的芯片通道數目3000;芯片的通道數目越多,通量越大。
1.6 建庫測序事項
盡量保留大分子DNA