Circular RNA的產生機制、功能及RNA-seq數據鑒定方法

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【Circular RNA的產生機制】

Circular RNA，縮寫為circRNA，中文名為環狀RNA，屬於非編碼RNA，是近年的一個重要研究熱點。

CircRNA主要是通過backsplicing的方式產生，明顯不同於線性RNA（linear RNA）經典的5′–3′的模式。因此，circRNA不含有線性RNA的經典結構，如5′端加帽，3′端有poly A尾巴等，而是形成了一個環狀。

CircRNA按照含有的外顯子和內含子模式，主要可以分為以下四類：

1）單外顯子circRNA，single exon circRNA；

2）多外顯子circRNA，multi-exon circRNA；

3）外顯子和內含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；

4）內含子circRNA，intronic circRNA；

具體如下圖所示：

CircRNA的四種主要類型示意圖（圖片來源：Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

 

CircRNA的表達模式多樣且復雜（具體如下圖所示）。比如GCN1L1基因產生的circRNA在人類中明顯表達，但在小鼠中卻很少表達（如下圖B所示）。而且，circRNA的剪接模式多樣，其中，alternative back-splicing有5′端和3′端兩種模式，alternative splicing模式有Cassette exon，Alternative 5' splicing，Intron retention和Alternative 3' splicing四種不同模式（具體如下圖C所示）。

CircRNA表達模式的復雜性（圖片來源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

 

【Circular RNA的生物學功能】

越來越多的研究表明，circRNA具有多種重要的功能，且與各種疾病特別是癌症的發生、發展密切相關。其中，circRNA發揮功能的兩種常見模式，是作為miRNA和RNA綁定蛋白（RNA binding protien，RBP）的sponges（具體如下圖所示）。

CircRNA作為miRNA和蛋白的sponges示意圖（圖片來源：Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

 

除此之外，circRNA還有其他重要的潛在功能，如可翻譯產生蛋白（如下圖VI所示）、假基因的產生來源（如下圖VII所示）、作為潛在生物標志物（如下圖VIII所示）。所以，circRNA具有非常多樣的生物學功能，這也奠定了其重要的研究地位。

CircRNA的各種潛在功能機制示意圖（圖片來源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

 

【Circular RNA與疾病特別是癌症的關系】

目前，已經有很多研究表明，circRNA與各種疾病特別是癌症的發生發展密切相關。如下面Table 1所示的一些circRNA可以作為miRNA的sponges，且在特定的腫瘤中起到了腫瘤抑制基因或致癌基因的功能。

一些在腫瘤中起到腫瘤抑制基因或致癌基因功能的circRNA（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

 

下表還顯示了，一些已報道的與局部缺血性心臟病、阿爾茲海默症、糖尿病相關的重要circRNA，它們的具體作用機制可見下面的Table 2所示。

CircRNA在局部缺血性心臟病、阿爾茲海默症、糖尿病中具有重要的功能（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

 

此外，已有的研究還報道了circRNA與各種人類癌症密切相關，在相應的癌症中，這些circRNA的表達顯著上調或顯著下調。這些癌症包括：Gastric Cancer，Colon Cancer，Bladder Cancer，Hepatocellular Cancer，Oesophageal Cancer，Lung Cancer等。具體如下面的Table 3所示。

一些已知的circRNA與各種人類的癌症緊密相關（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

 

【Circular RNA的RNA-seq鑒定及實驗驗證方法】

CircRNA可以通過RNA-seq技術進行大規模的鑒定。因為circRNA不含有poly A尾巴，所以circRNA主要富集在沒有ploy A尾巴的RNA中，建議使用poly (A)- RNA-seq技術或 用RNase R降解線性RNA后的poly (A)- RNA-seq技術（具體如下圖A所示）。傳統的poly (A)+ RNA-seq技術主要富集了線性的RNA；而ribo- RNA-seq技術，主要只去除了核糖體RNA（rRNA）。

進行RNA測序后，就可以使用生物信息學工具或方法在全基因組范圍內鑒定circRNA。目前基於RNA-seq測序數據鑒定circRNA的方法主要是通過檢測是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site，即circRNA的首和尾連接處的序列（具體如下圖A中的右圖所示）。​

基於RNA-seq數據鑒定出circRNA后，如果想進一步確認鑒定結果的可靠性，還可通過實驗來驗證預測的circRNA。如通過PCR、Northern blot或RNA FISH等（具體如下圖B所示）。

CircRNA的生物信息學鑒定（A）和實驗驗證方法（B）（圖片來源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

 

至今為止，已經有眾多軟件相繼被開發出來基於RNA-seq數據鑒定circRNA，這些軟件使用的方法主要可以分為以下三大類：

1）Indirect and Multi-Stage Approaches；

2）Approaches Directly Employing Chimeric Reads；

3）Tools Using Statistical Approaches。

 

下表列出了一些基於RNA-seq數據鑒定circRNA的主要軟件：

基於RNA-seq數據鑒定circRNA的一些主要軟件信息（圖片來源：Jakobi et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2019）

 

而且，目前已有多個關於circRNA的數據庫可供大家使用，這些數據庫中含有了豐富的circRNA信息，包括circRNA-miRNA相互作用、circRNA-RBP相互作用等（具體如下表）。

關於circRNA的一些重要數據庫信息（圖片來源：Jakobi et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2019）

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