做了好久的RNA-seq分析，基因表達也在口頭溜了幾年了，但似乎老是浮在表面。
對一件事的了解程度決定了你的思維深度，只想做技工就不用想太多，想做大師就一定要刨根問底。
老是說基因表達，那么什么是基因表達？我們測序得到的基因表達其實只是一種表型，是樣本的一個快照，和普通的身高體重之類的連續型表型類似。
常規的轉錄組分析本質上都是表型分析，clustering、pseudotime、DEG、marker，在這些分析中，每個基因都是獨立的維度，屬於靜態的分析，此時我們關注的是某個基因的功能分析，比如RET，功能已經明確，那就可以用基因表達這個表型來解釋另一個表型。
高通量測序還會有后續的分析，幾萬個基因不可能一個一個的研究，GO和KEGG分析就來了，基因不是互相獨立的，GO term和pathway的概念就來了。GO和KEGG的本質是規范了基因之間的關系。GO整合了所有物種，是從生命系統的角度來統一基因的關系，這種關系只是一個集合；KEGG是針對一個物種來界定基因之間的關系，這種關系是有向圖結構。必須再深入了解GO和KEGG的制作原理，暫時不深入。此時我們開始區分基因類型，蛋白編碼、非編碼、轉錄因子。在這個階段我們更關注的是基因之間的調控關系。
中心法則揭示了生命系統的層級和管道結構，和計算機的通信系統很類似，就算上游的基礎調控再復雜，下游的蛋白都是決定性因素，所以令人驚嘆的是上游調控如此復雜多變，可下游的蛋白確是非常穩定，這說明復雜多變的調控是非常穩定的。
基因研究的第一步必然是基因的功能，其次才是基因的調控。
基因功能
那么如何研究一個基因的功能呢？參考：＃基因組觀＃基因功能研究的“七大絕招”與“三板斧” - BioinforCN
簡單總結一下這篇文章：
1. 天地人和，研究基因表達的時空規律來推測功能，這和偵探調查是一樣的，屬於間接推理；
2. 患得患失，就是直接操作基因，knock out或down或overexpress，來直接探索基因的功能，屬於直接觀察；
3. 上下求索，因為中心法則是個層級和管道系統，上下游十分明確，從基因的DNA、RNA到蛋白質，一起研究；
4. 十面埋伏，立體論證，做生物的很容易觀察到假陽性，必須多角度論證；
5. 其他的，misexpression、in vitro/vivo。
不說人類hs了，假設你負責一個全新的物種的基因組和基因功能研究，你如何找到該物種的所有基因呢？
看任何一篇基因組組裝文章都能找到解決方案。那我們就看看嚴建兵的最新的玉米的NG吧，Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement。
微信文章：《Nature Genetics》| 玉米產量相關基因找到了 | 熱帶玉米基因組及高精度結構變異圖譜成功構建，助力玉米遺傳改良
首先是基因組DNA的組裝，Genome sequencing, assembly and scaffolding，這部分純技術，以后估計都不要組裝了，直接把基因組測出來；
其次就是基因組注釋了，Genome annotation，這部分是我們現在最感興趣的部分，如何找到一個新物種內的所有基因？
A comprehensive strategy combining de novo gene prediction, protein-based homology searches, RNA sequencing (RNA-Seq) and isoform sequencing (Iso-Seq) of nine tissues (Supplementary Table 6) was used to annotate the genes (Supplementary Fig. 7).
方案來了：
1. 基因是有特殊結構的，所以只要有DNA序列，就可以做denovo預測；
2. 中心法則告訴我們DNA、RNA和蛋白質是環環相扣的，所有測RNA-seq和iso-seq可以間接推出基因；
3. 蛋白測序還沒有普及，所以目前都用的同源蛋白序列來反推；
這樣注釋出來的只是很general的基因注釋，能cover絕大多數基因，但某些特殊結構的肯定無法注釋出來。
有了草圖，后面再做實驗的功能研究就會方便很多。
基於高通量測序的前兩步只能告訴你基因組的這個地方是個基因，但是不可能告訴你它的功能；第三步就是基於已有的知識了，做同源推理。所以目前來看所有的生物知識都是來源於實驗的，測序只是一個加速的輔助手段而已。
可以沒有測序，但是不能沒有實驗，測序是科研加速的催化劑。
文章結果：
GENE FINDING METHODS - broad institute - 很全面
基因表達調控/轉錄調控
教科書解釋：
- 染色體和染色質水平的結構變化，導致基因活性變化；Hi-C，bulk平均好些，sc的量太少不靠譜
- 轉錄水平調控；轉錄因子，enhancer，promoter，ncRNA
- RNA加工水平調控，剪切修飾編輯降解；甲基化，lncRNA抑制降解
- 轉錄后，細胞核向細胞質轉運；HDAC4
- 翻譯水平；
- 蛋白合成水平；蛋白修飾定量，不是AA測序
目前最火的兩個可以用高通量測序研究的調控方法：
- 轉錄因子，enhancer，promoter
- 非編碼RNA，lncRNA、miRNA、ceRNA
參考：
Modes of transcriptional regulation
Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease
項目問題：
現在in vivo和in vitro模型都已成熟，RNA-seq成本大家都可以接受了，CRISPR技術也成熟了，KO一個基因已經變得非常容易，現在發育生物學、生物醫學等都在這么做：KO一個基因，來探索自己感興趣的生物過程發生了哪些變化。
現在問題來了，KO后表型肯定發生了變化，那么如何把這個表型和基因表達和調控聯系到一起呢？
這是一個general的問題，解答好了可以用於任意一個基因的深入研究。
大體解決方案：
假設檢驗是科研獲取真知的唯一手段，首先我們必須要一個合理的假設，然后去尋找各種證據來test這個假設。
沒有假設和驗證就不是做科研，那就是一個技工得出一份沒有意義的結題報告。
問題：
1. RNA-seq的建庫方案有哪些？ployA、隨機等。只抓有polyA的MRNA會有哪些優勢和缺點？ployA只有mRNA有，所以polyA建庫只能抓到蛋白編碼基因，很少部分地ncRNA。參見鏈接
2. 細胞核和全部測序的區別？
3. 基因的長度差別到底有多大？
4. 可變剪切和isoform是如何影響蛋白的？
5. KEGG里面已經有基因的關系了，為什么我們還要研究基因調控？
6. 蛋白互作網絡的用途和局限性是什么？
7. 蛋白是唯一的決定性因素嗎？是的，絕大多數DNA和RNA層面的變化都會最終改變蛋白的功能。比如HSCR的無法形成ENS就是一個復雜的表型，可以肯定的是某些蛋白的功能執行紊亂了。
8. 基因表達的高低重要，還是基因表達的on/off重要？
9. 基因是如何找到和定位的？基因的編碼的蛋白是如何確定的？
10. 如何理解基因之間的關系，是什么性質的關系？
11. 如何立即基因的拷貝數對基因表達的影響？
12. transposable-element對基因表達的影響？
13. 基因的經典結構是什么樣的？什么是CDS和UTR？可以結合目前主流的基因預測工具來看。
14. 轉錄調控和蛋白互作有什么聯系和區別？
Typical structure of a mature eukaryotic mRNA (AUG, UAA/UAG/UGA)
待續~