HISAT2+StringTie+Ballgown安裝及使用流程
2015年Nature Methods上面發表了一款快速比對工具hisat，作為接替tophat和bowtie的比對工具，它具有更快的比對速度和更高的比對率，最近把這個流程走完一遍，感覺優勢還是很明顯的。
一、HISAT2：
1、下載安裝：
hisat2下載地址：ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
hisat2官方手冊：http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml
下載完成后解壓縮：
unzip hisat2-2.0.5-Linux_x86_64.zip
進入hisat2-2.0.5文件夾：
這里面的綠色文件都是可執行文件，所以只需要把目錄添加到環境變量中即可：
vim進入編輯bashrc文件，在文本中輸入紅色方框內的內容，保存退出，然后source ~/.bashrc 即可
此時我們就可以直接調用hisat2命令了。
2、建立索引：
如同tophat一樣，比對之前需要利用bowtie建立index，hisat2同樣需要建立索引：
首先提取gtf文件中的剪切位點和外顯子位置：
extract_splice_sites.py gencode.vM4.annotation.gtf >gencode.vM4.annotation.for.hisat2.ss
extract_exons.py gencode.vM4.annotation.gtf >gencode.vM4.annotation.for.hisat2.exon
建立索引：
hisat2-build -p 30 --ss gencode.vM4.annotation.for.hisat2.ss --exon gencode.vM4.annotation.for.hisat2.exon GRCm38.p3.genome.fa mouseGencodeIndex
##如果電腦內存<200G，那么可以不用--ss/--exon參數，但是在比對的時候需要加
--known-splicesite-infile參數。3、比對：
我的數據是雙段的無鏈特異性數據，此處需要把sam文件轉化為bam文件，所以需要提前安裝samtools：
hisat2 --known-splicesite-infile gencode.vM4.annotation.for.hisat2.ss --dta -t -p 24 -x mouseGencodeIndex -1 samp_1.fq.gz -2 samp_2.fq.gz -S accepted_hits.sam &> alignment_summary.txt
samtools view -bS accepted_hits.sam > accepted_hits.bam
samtools sort accepted_hits.bam -o accepted_hits_sorted.bam
rm accepted_hits.bam
rm accepted_hits.sam
二、StringTie：
比對完生成了sam文件，我們利用samtools將它轉化為了排好序的bam文件，下一步就需要量化和確定表達值了，這里用到的StringTie相比之前的cufflinks來說功能強大了好多。
1、下載安裝：
stringtie下載地址：http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/stringtie-1.3.3b.Linux_x86_64.tar.gz
stringtie官方手冊：http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml?t=manual
直接下載解壓就可以用了，它是可執行文件，也可以按上述方法將路徑添加到環境變量中方便調用。
2、運行：
stringtie accepted_hits_sorted.bam -o outRes.gtf -p 28 -G gencode.vM4.annotation.gtf -A gene_abund.tab -B -e
運行后每個樣本文件夾下結果如下：
這里我生成了結果gtf文件outRes.gtf和ballgown需要的.ctab文件，還有基因的表達量文件gene_abund.tab，該文件包括基因的表達量FPKM以及TPM等。當然如果你想要轉錄本的表達量，直接打開t_data.ctab這個文件，這里面有轉錄本的FPKM值。
當然如果我們想利用DESeq2或者edgeR等計算差異表達，那我們就需要得到原始counts值矩陣來作為輸入，此時我們需要利用StringTie自帶的腳本prepDE.py來計算counts值，它可以同時對多個樣本做：
prepDE.py -i stringtieRes/ -g countsRes/gene_count_matrix.csv -t countsRes/transcript_count_matrix.csv
stringtieRes/文件夾下面是我所有的樣本的文件夾。
*這里我們能得到所有樣本的count matrix，但是只能拿到每個樣本對應的FPKM值，又有什么方法能得到合並在一起的FPKM matrix呢？這就需要借助ballgown了。
三、Ballgown：
1、安裝：
首先你需要下載安裝R，我的是3.4.0版本。
source("https://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("ballgown")
這里可能提示你安裝XML包的時候會出現錯誤提示：Cannot find xml2-config
這就需要你在自己電腦上安裝相應的模塊了，我的是centos7，於是安裝相應的模塊：
yum install libxml2-devel
順利安裝上ballgown包。
2、使用：
讀取所有樣本到ballgown對象中：de>
bg = ballgown(dataDir=de>de>de>YSde>, samplePattern='YT1', meas='all');
#其中de>de>YS是我的所有樣本的父目錄，每個樣本文件夾名字都包含YT1。
#計算轉錄本和基因的FPKM值
de>de>transcript_fpkm = texpr(bg, 'FPKM')
row.names(de>de>de>transcript_fpkmde>) = transcriptNames(bg)
write.csv(de>de>transcript_fpkm,"de>de>de>transcript_fpkm_matrix.csvde>")
de>de>gene_expression = gexpr(bg)
de>de>write.csv(de>de>de>gene_expressionde>,"de>de>de>de>gene_fpkmde>_matrix.csvde>")
任務完成。
3、差異表達分析：
ballgown可以做case/control兩兩比較的差異表達，也可以做多組比較的差異表達（此時不能計算Fold Change值），
當然也可以做時間序列的差異。
de>de>de>pData(bg) = data.frame(id=sampleNames(bg), group=rep(c(1,0), each=10))
#這里是條件矩陣，每行是一個樣本，第二列是條件，如果是case/control那么就是0/1.
de>de>de>de>stat_results = stattest(bg, feature='transcript', meas='FPKM', getFC=TRUE, covariate='group')
#注意getFC在多組比較時候不能用，feature參數可以對基因'gene'或者轉錄本'transcript'或者外顯子'exon'做
差異表達分析。
de>de>de>de>de>Data(bg) = data.frame(pData(bg), time=rep(1:10, 2)) #dummy time covariate timecourse_results = stattest(bg, feature='transcript', meas='FPKM', covariate='time', timecourse=TRUE)de>
de>
但是我個人不太推薦使用ballgown，喜歡使用DESeq2和edgeR來計算。
de>