MIT molecular Biology 筆記10 翻譯

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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

 

翻譯

　　翻譯機器的組成

• mRNA
• tRNA
• aminoacyl tRNA synthetase
• ribosome

一、信使RNA

1、多肽鏈是由可讀框決定的

• 含有多個ORF的mRNA叫多順反子
• 只有1個ORF的mRNA叫單順反子

2、原核細胞mRNA具有核糖體結合位點，可以募集翻譯機器

• 核糖體結合位點（RBS）
• 一般位於

   

  密碼子5'端 3~9bp內
• 與核糖體 16S rRNA 的 3'端互補（5' CCUCCU 3'）
• 某些原核細胞ORF缺乏RBS也能翻譯，是因為ORF緊接着上一個ORF：翻譯耦合translational coupling

3、真核細胞mRNA在5' 和 3' 被修飾，促進翻譯

• 真核mRNA的 5'帽是甲基化鳥嘌呤核苷酸
• 可以募集核糖體結合
• 核糖體向下游掃描，尋找AUG

 

• 在某些mRNA中，起始密碼子周圍有些保守位點
  
• 5'- G/ANNAUGG-3' Kozak序列：與起始tRNA互作
• 3' poly-A 尾： 增強5'Cap 的募集作用
• 帽和尾 穩定RNA

 

二、轉運RNA

1、tRNA是密碼子與氨基酸之間的轉配器

　　特征

• 3'端均為5'-CCA-3' ：氨基酸結合位點
• 存在特殊鹼基：
   
• ΨU 假尿嘧啶
• D 雙氫尿嘧啶
• H 次黃嘌呤
• T胸腺嘧啶
• Gm 甲基鳥嘌呤

2、共有三葉草二級結構

• 受體臂
• ΨU loop
  

   

• D loop
• anticodon loop
• variable loop

3、tRNA具有L形三維結構

 

 

三、氨基酸連接到tRNA上

1、氨基酸通過高能酰基連接到tRNA 3'端腺苷酸上使tRNA負載

• 腺苷酰基化 adenylylation（ATP）
• tRNA負載

 

2、每種氨酰-tRNA合成酶連接一種氨基酸到一種或多種tRNA上

 

　　每個氨基酸對應一種合成酶

• 特殊的合成方式：Glu合成到tRNA^Gln，Glu在氧化成Gln

3、tRNA合成酶識別位於同族（cognate）tRNA上獨特結構特征

• 受體臂上鑒別者鹼基
• 反密碼子環

4、保證氨酰-tRNA合成的精確

• 酶口袋的尺寸阻止大氨基酸進入
• 酶中的編輯口袋水解尺寸過小的氨基酸
• 那么只有正確的氨基酸能合成

5、核糖體不能辨別tRNA的負載是否正確

6、硒代半胱氨酸

• 存在於谷胱甘肽過氧化物酶，甲酸鹽脫氫酶
• 由UGA終止密碼合成：特殊地機制

四、核糖體

• DNA復制速度 200~100bp/s
• 轉錄速度 50~100bp/s
• 翻譯 原核 20AA/s   真核 2~4AA/s

1、核糖體由一個大亞基，一個小亞基組成

• 大亞基：肽基轉移酶中心 peptidyl transferase center
• 小亞基：解碼中心 decoding center
• 大小亞基按照沉降速錄命名（不和質量成嚴格正比）

2、核糖體循環

 

 

 

• 合成方向 N->C
• 形成肽鍵的過程：將正在延伸的多肽轉移到另一個tRNA上
• 肽鍵的形成不需NTP水解：氨酰-tRNA儲存着能量

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3、核糖體RNA是核糖體中結構和催化功能決定因子

• 以RNA為中心

4、核糖體有3個tRNA結合位點

• A 氨酰tRNA結合
• P 肽酰tRNA結合
• E tRNA離開位點

5、核糖體內的通道使mRNA與延伸多肽進出

 

五、翻譯的起始

• 核糖體募集
• 負載tRNA置於核糖體P位點
• 核糖體精確定位

1、原核細胞

• 三種起始因子指導 mRNA 和 tRNA 裝配起始復合物
• IF1 結合到A位點，防止起始tRNA結合
• IF2 GTP酶，促進起始fMet-tRNA_i^fMet結合至P位點，阻止別的結合
• IF3 與小亞基結合，阻止翻譯起始前大亞基結合（最后結合）
• 隨着起始因子的加入，小亞基准備好和mRNA，tRNA以任意順序結合
• 與mRNA結合：RBS 與 16S RNA相互作用
• 結合后，起始密碼子正好處於P位點
• 起始 fMet-tRNA_i^fMet 的結合：通過GTP與IF2相互作用
• 起始的Met被加上甲酰基（Met-tRNA轉甲酰酶） ：f-N -> C
• 起始密碼子與起始tRNA配對：小亞基構象變化，IF3釋放
• 大亞基結合（IF2作為初始對接位點），形成70S 起始復合體
• IF2、IF1 釋放
• 許多蛋白質不是以Met開始的，氨肽酶通常會在氨基酸切除Met及另外一兩個氨基酸 

2、真核細胞

 

• 真核細胞中tRNA結合先於mRNA的結合
• 使用另一組輔助因子
• 核糖體小亞基結合上mRNA 的 5'Cap，掃描AUG（ATP)
• 掃描到AUG后，組裝大亞基，開始翻譯
• 翻譯起始因子使真核mRNA保持環狀：提高翻譯效率

 

 

 

 

六、翻譯的延伸

• 氨酰-tRNA結合上A位點：EF-Tu-GTP輔助
• 延伸：肽酰轉移酶將多肽鏈加到A位點負載tRNA上
• 易位
• 在兩種延伸因子的輔助下，正確的閱讀ORF

氨酰tRNA結合

1、氨酰-tRNA由延伸因子EF-Tu送達A位點

• EF-Tu-GTP覆蓋tRNA3'端的氨基酸：防止過早反應
• 正確匹配結合上A位點后，大亞基的某結構域激活GTP水解
• EF-Tu-GDP釋放

2、核糖體利用多種機制排斥錯誤配對的 氨酰-tRNA

• 小亞基 16S RNA的兩個鹼基識別 tRNA-mRNA 之間的小溝：錯配小溝形狀不符合
• EF-Tu-GTP=tRNA復合物要處於正確位點，才能導致GTP水解
• 易位時，錯誤配對的tRNA容易脫落

 

肽鍵的形成

3、核糖體是一種核酶

• rRNA處於活性中心，蛋白起輔助作用
  • 熵催化 entropic catalysis
  • rRNA通過鹼基配對，將底物穩定在活性中心已促進反應
• 底物輔助催化
• P 位點 tRNA 的 2'OH 通過質子穿梭機制輔助催化

 

易位

4、肽鍵的形成啟動大亞基中的易位反應

• 大亞基的易位先於小亞基

5、EF-G推動易位

• EF-G-GTP結合在大亞基上
• EF-G-GTP水解形成EF-G-GDP 構象改變，占據A位點
• 推動小亞基中的易位
• 多米諾骨牌似的使得P位的tRNA易位向E
• 稀有移碼tRNA（4bp）補償移碼錯誤

　　EF-G-GTP 的 分子擬態：

• EF-G-GTP 的形態很像 EF-Tu-GTP=tRNA復合物

6、EF-Tu-GDP 和 EF-G-GDP 在新一輪延伸前，要將GDP換成GTP

• EF-Ts促進 GDP與 EF-Tu解離
• EF-G 與 GDP親和力<GTP親和力，直接換

　　

 

7、形成肽鍵的一個循環消耗兩個GTP，一個ATP

• 氨酰-tRNA的形成 1ATP
• EF-G-GTP 牽引氨酰tRNA正確匹配 1GTP
• EF-G-GDP推動易位 1GTP

翻譯的延伸中，原核與真核很相似

EF-Tu ：eEF1

EF-G  ：eEF2

 

七、翻譯的終止

1、釋放因子在終止密碼子的作用下終止翻譯

 

• 核糖體循環在 終止密碼子進入 A 位點后，就停止
• 終止密碼子被釋放因子識別 release factor
• 兩類釋放因子
• I 類釋放因子識別終止密碼子：RF1 、RF2
• II 類釋放因子：釋放肽鏈后，刺激 I 類因子從核糖體解離

2、I 類因子的一小段區域識別終止密碼子，並催化多肽鏈的釋放

•  I 類釋放因子上的肽反密碼子識別終止密碼子
•  I 類釋放因子的GGQ序列促進了多肽鏈的釋放
•  I 類釋放因子功能上模仿了tRNA

3、II 類釋放因子的功能受GTP、GDP調控

 

4、核糖體循環因子模仿tRNA

 

• 核糖體循環因子（RRF）識別結合A位點
• EF-G-GTP結合核糖體，GTP水解，占據A位點，促使RRF易位至P
• 兩個tRNA脫落
• IF3 加入 EF-G-GDP脫落

 

 

 

 

八、翻譯的調控

• 翻譯主要在起始階段調控

1、蛋白質或RNA在RBS附近結合負調控細菌翻譯的起始

• RNA分子的配對會被核糖體打破，后續的核糖體可以識別

2、原核翻譯調控：核糖體蛋白是其自身結合翻譯的抑制因子

• 原核核糖體蛋白基因的協同調控通過若干操縱子得以簡化
• 核糖體蛋白翻譯的自我抑制：
  • rRNA充足時，核糖體蛋白首先結合rRNA
  • rRNA缺乏，核糖體蛋白結合自己的mRNA RBS附近
  • 阻止翻譯
  • 

     

 3、真核翻譯總體調節因子以mRNA識別及起始tRNA結合所需關鍵因子作為靶標

• mTor因子對4E-BP的磷酸化與翻譯的調控
• 磷酸化的4E-BP不能結合5'Cap，翻譯進行
• 這是化療葯物的靶點 雷帕霉素

 

4、對mRNA特異的4E-BP進行翻譯空間的調控

• 果蠅卵母細胞護送Oskar mRNA從前向后運輸

 

 5、鐵離子調控轉鐵蛋白翻譯

 

6、酵母轉錄激活因子Gcn4 的翻譯受到上游短ORF及三元復合物豐度的調控

• Gcn基因上游4個小的可讀框
• 翻譯完第一個可讀框的核糖體剩下一個小亞基在mRNA上
•  氨基酸充足，因素介導，小亞基迅速結合三元復合物，尋找下一個ORF起始密碼
• 氨基酸缺乏時，小亞基結合三元復合物變慢，小亞基移出小ORF區后，才結合上，識別下游Gcn4基因起始密碼，翻譯

多聚核糖體譜

• 被核糖體結合多的就是翻譯活躍的

九、依賴翻譯的mRNA和蛋白質穩定性調節

•  mRNA會出錯，但在翻譯中被識別出來之前，它是穩定的

1、原核生物

• 缺乏終止密碼子
• 核糖體在3'末端停滯，A位空缺
• SsrA RNA 加入A位點
• 類似正常的轉肽和易位反應，將前面的tRNA和mRNA踢出
• SsrA RNA加入后翻譯出來的多肽帶有10個氨基酸的標簽，招募蛋白將其降解

 

2、真核生物

① 無意義密碼子介導的mRNA衰減

• 真核生物mRNA經過剪接后，會留有 外顯子拼接復合物
• 正常的翻譯，核糖體會將一路上的 拼接復合物清除
• 如果提前終止了，就有 拼接復合物無法清除
• 招募5'->3'、3'->5'外切酶清除mRNA

② 無終止密碼子介導衰減

• 真核mRNA以poly-A結尾
• 無終止密碼子，會翻譯出尾端的多個 AAA（賴氨酸）
• 招募降解mRNA 和 蛋白質

③ 末端終止介導的衰減 no-go decay

• 當核糖體因為二級結構，或者相關tRNA不夠用時，停滯，招募降解

 

 

十、遺傳密碼

1、遺傳密碼的簡並性

• 密碼子第一位改動改變氨基酸
• 第二位：嘧啶往往疏水；嘌呤往往極性
• 第三位：較少會發生氨基酸的改變

2、遺傳密碼的擺動性

反密碼子	密碼子
G	U 、C
C	G
A	U
U	A、G
I	A、U、C

3、遺傳密碼遵循3條規律

• 5'->3' 閱讀
• 密碼子不重疊，信息間不重疊
• 固定可讀框上翻譯

4、突變與抑制突變

• 錯義突變
• 終止突變
• 移碼突變

 

• 一個鹼基缺失導致移碼突變：可以由隨后增加一個鹼基的突變補償
• 因為突變產生的提早的終止子可以被特殊的tRNA搶先讀取，

 

5、遺傳密碼幾乎通用