MIT Molecular Biology 筆記5 轉錄機制

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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

 

轉錄機制

一、RNA聚合酶和轉錄周期

1、

• 細菌：一種轉錄酶
• 真核：三種轉錄酶（植物+2種）
• Pol I   大核糖體RNA前體
• Pol II  幾乎轉錄所有蛋白質編碼
• Pol III tRNA，小的核RNA基因，5S人RNA基因
• （Pol IV、V 植物中，參與轉錄小干擾RNA）

 

細菌聚合酶的核心酶可獨立合成RNA

• 2 * α + β + β'_大亞基 + ω
• 酶的形狀像個蟹爪
• 鉗子基部有活性中心裂隙
• 依靠雙金屬離子催化合成反應
• 位點結合一個Mg²⁺
• 另外一個離子隨人NTP進入隨PPi釋放
• 酶上有多種通道

2、由RNA聚合酶進行的轉錄是由一系列步驟完成的

• initiation
  • promoter 最初結合RNA聚合酶的序列
• elongation
  • 合成了10個鹼基以后，便進入延伸階段
• termination

 

3、轉錄的起始包含三個定義明確的步驟

• 閉合復合體的形成
  • 雙鏈狀態
  • 聚合酶結合在一個面上
• 轉變為開放復合體
  • 雙鏈在起始位點13bp距離內形成轉錄泡
  • 此時復合體叫：轉錄起始復合體（initial transcribing complex）
  • 最初10bp合成效率相當低，會不斷合成小片段釋放
  • 合成超過10bp，聚合酶逃離啟動子
• 啟動子逃離，進入轉錄起始階段

原核的轉錄 

二、細菌的轉錄周期

1、細菌的啟動子在強度和序列上是多樣的

• 原則上細菌RNA聚合酶核心酶可以在DNA分子的任意一點開始轉錄
  • 但是聚合酶不能打開雙鏈
• 但是在細胞內 ，有σ起始因子的參與，聚合酶只在啟動子處轉錄
• σ + 核心酶 = 全酶（holoenzyme）

 

細菌啟動子元件有不同的組合情況

 

• 大腸桿菌最常見的σ因子是σ⁷⁰ 具有如下特征
  • 兩段6核苷酸長的保守序列
    
    • -10， -35
  • 被長度17-19bp的非特異性序列隔開

• 啟動的蛋白所識別的共有序列越相近，啟動子越強
• 單位時間內轉錄產物越多
• 啟動子的強度 與以下因素相關
• 啟動子最初與聚合酶的結合程度
• 異構化作用的支持效率
• 此后聚合酶逃離的難易程度
• 這解釋了表達水平的差異

 

• 較強的啟動子中（如指導rRNA）有UP-element
• 提供額外的特異性
• 缺失-35區的σ⁷⁰擁有上游延長-10區，以補償
• 大腸桿菌gal基因
• -10下游有鑒別子（discriminator）（都有？？）
• 與聚合酶作用影響穩定性

2、σ因子介導聚合酶與啟動子的結合（形成閉合復合體）

• σ⁷⁰ 有4個結構域

• -35 被區域4的兩個螺旋形成 helix-turn-helix識別
• 一個插入-35 大溝，與鹼基作用
• 另一個從大溝頂部橫穿過，與骨架接觸
• 與-35的結合提供能量確保聚合酶-啟動子結合
• 這一種motif結構見於很多DNA結合蛋白（轉錄激活、抑制因子）

• -10 被區域2α螺旋識別
  • 螺旋包含幾個芳香氨基酸
  • 可以與非模板鏈相互作用維持解旋DNA的穩定（類似SSB）

• • 區域2結合一個單鏈狀態的-10element
  • 非模板鏈鏈上的兩個鹼基插入σ的口袋中

•  -10 的延長序列被結構域3識別
  
• 鑒別子由結構域1、2識別
• UP-element 不被 σ 識別，被α亞基羧基端αCTD識別
• 區域3.2被稱為3/4連接區

 

3、向開放式復合體的轉變涉及RNA聚合酶和啟動子DNA的結構變化

　　異構化作用（isomerization）

• 異構化作用不需ATP ，依靠優勢構相驅動
• 異構化不可逆，開放式復合體形成后，轉錄隨后起始
  • 相反，閉合式復合體的形成是可逆的 

 

•  在活性中心內，DNA從+3位置開始分離
• 聚合酶后的上游DNA在-11位置重新恢復雙鏈
σ因子 N 端（1.1）起到分子模擬物（molecular mimic）的作用（+電）
• 結合DNA前，是1.1結合在活性中心

 4、轉錄由RNA聚合酶起始，不需要引物

•  聚合酶需與一條或多條DNA模板鏈，起始核苷酸以及第二個核苷酸建立特異性作用
• 嚴格控制方向
• 大多數轉錄物以同一核苷酸開始
• σ的3/4linker 與模板鏈互作，，確保正確位置和構象啟動轉錄

5、轉錄的起始階段RNA聚合酶保持位置不變，並將下游DNA拉向自己

• 三種模型
  • 瞬時漂移
  • 蠕蟲移動
  • 蜷縮

• 單分子實驗（FRET）支持蜷縮模型
  • 聚合酶下游的DNA被酶拉進來，在內部形成泡結構

6、啟動子的逃離涉及聚合酶-啟動子相互作用 以及

　　聚合酶核心-σ相互作用的破壞

• 一旦合成長度達到10bp，轉錄物變要穿入酶的RNA出口通道
• σ3/4作為分子模擬物占據RNA出口通道
• 合成達到10bp，RNA鏈便將σ3/4逐出
• σ也常常會從延長酶上丟失
• 逃離后，轉錄泡從22-24bp縮小為12-14bp
  • 這會釋放能量，讓聚合酶離開啟動子並驅逐σ因子

 有些生物如大腸桿菌噬菌體T7是單亞基聚合酶，沒有σ因子，但也有類似的結構變化以讓合成超過10bp的RNA穿出RNA通道

7、延伸聚合酶是一個邊合成邊校對的機器

•  增長中的RNA有8-9個鹼基與DNA保持互補
• 聚合酶每前進相當於單核苷酸長度的一步，3'端添加一個核苷酸
• 轉錄泡的大小不變

轉錄酶的校對機制（proofreading）

• 焦磷酸編輯 pyrophosphorolytic editing
  • 是rNTP合成的逆反應
  • 錯配導致合成速度減慢（空間位點不正確）
  • 聚合酶利用空間結構特性短暫限制PPi的離開
  • PPi + RNA_n = RNA_n-1 + rNTP
• 水解編輯 hydrolytic editing

   

  • 聚合酶倒退入rNTP進入通道（利用環境中的熱,0°C不發生，37°C發生）
  • Gre因子（E.coli）、TFIIS（真核）進入
  • 水解

 

8、聚合酶可能會因為模板損傷停滯不前，需要被挪走

　　TRCF挪走停滯的聚合酶，並且招募修復酶

• TRCF結合上游雙鏈（依靠ATP），並且尋找到停滯的RNA聚合酶
• 推動聚合酶向前合成，或者令三重復合體解離
• 招募轉錄藕聯修復酶（UvrA、B、C）

9、轉錄由RNA序列內部信號停止

• Rho依賴型
• Rho（ATP依賴）從rut位點結合單鏈
• 尋找聚合酶
• 將RNA扯出，或像TRCF一樣作用

Rho的結合有特異性：

• Rut位點理想：40bp，不折疊為二級結構，富含C
• 不結合正在翻譯的RNA
  • 故在細菌中，是等轉錄超過一個基因（編碼序列）后才終止的

 

最近研究顯示Rho因子是通過轉錄循環早期與RNA聚合酶結合

隨着轉錄易位

易位導致緊綳

到一定程度，將酶終止

• Rho非依賴型

   

• 非依賴型終止子也稱固有終止子（intrinsic terminator）
• 組成
• 反向重復序列
• 8個U
• 形成發夾，引發相關信號，轉錄物脫離

 

 

 

 

 

真核的轉錄

三、真核生物的轉錄

• 真核生物的轉錄除了需要聚合酶外，還需要通用轉錄因子General transcription factor，GTF
• 在體內，由於有核小體，轉錄還需要
• DNA結合調節蛋白
• 中介蛋白復合體
• 染色質修飾酶

1、RNA聚合酶II的核心啟動子由4個不同序列的元件構成

• TFIIB識別元件
• TATA元件
• 起始子（Inr）
• 下游啟動子元件（包括DPE、DCE、MTE）

　　核心啟動子之外，存在的在體內進行有效轉錄所需的其他序列元件。共同組成調節序列

• 啟動子最近元件（promoter proximal element）
• 上游激活物序列（upstream activator sequence，UAS）
• 增強子
• 沉默着子
• 邊界元件
• 絕緣子

 

 

 2、RNA聚合酶II在啟動子上和通用轉錄因子形成前起始復合物

 

•  TFIID由TBP（TATA Binding Protein)與TAF(TBP Associated Factor)組成
• TFIID 的TBP 識別TATA box
• 真核的啟動子解旋需要TFIID的ATP水解介導
• 還需要聚合酶CTD磷酸化

 

3、啟動子的逃離需要聚合酶的尾巴磷酸化

• Pol II 的CTD由連續重復7肽序列
• Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
• 每個重復序列都有激酶磷酸化位點
• TFIIH的一個亞基由激酶功能

4、TBP用插入雙螺旋小溝的β折疊來結合並扭曲DNA

• 結合的特異性來自插入到識別序列兩端的鹼基對，這由驅動DNA發生強烈彎曲的兩對苯丙氨酸的側鏈實現

5、其他通用轉錄因子在起始中也有特殊作用

 

6、體內的轉錄需要其他蛋白的參與，包括中介蛋白復合體

聚合酶的CTD尾巴結合有mediator，它有助於聚合酶分子定位到啟動子

• mediator的一個表面結合Pol II CTD尾巴
• mediator另外的表面結合其他起始因子
• 如果缺失中介蛋白，常會導致一些基因失去表達
• 中介蛋白把聚合酶定位到不同的啟動子上

• 在TFIIH水解ATP的介導下，雙鏈打開，轉錄起始
• 加帽酶5’端加帽

 

7、一組新的因子激發Pol II 延伸 和RNA校對（proofreading）

• NELF ：負延伸因子
• DSIF ：DRB敏感因子 
• 它們抑制早期轉錄，使得轉錄在+25 ~ +60處停止
• P-TEFb會使得重新開始轉錄
• 

 

8、聚合酶延伸過程中對抗組蛋白的阻礙

• FACT 通過暫時挪開一個H2A·H2B二聚體方便轉錄

 

9、延伸聚合酶與各種RNA加工所需的一組新蛋白質相互作用  

• 5'端加帽
• 轉錄poly-A信號
• 相關蛋白募集
  • CSTF
  • CPSF
• 切割
• 多聚腺苷酸化
• 終止
  • 魚雷模型較受認可
  • Rat快速消化正在合成的5'沒有帽的RNA
  • 達到聚合酶時，將RNA鏈扯出消化

 

 

 四、由聚合酶I和聚合酶III催化的轉錄

1、聚合酶I 聚合酶III識別不同的啟動子，但仍需TBP

2、Pol I 只用於轉錄RRNA基因

• UBF結合UCE
• 引入SL1（由TBP與TAF組成)
• 募集Pol I 至核心啟動子，激發轉錄

 

3、Pol III 的啟動子位於轉錄起始點的下游