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教材 Molecular biology of the gene 7th edition J.D. Watson et. al
DNA的復制，染色體組裝
一、Replication Enzymes 復制酶
1、酶結構：
- 手狀結構。thumb不動，而finger動。
- 手掌：①聚合作用。
- β折疊片層
- 2個二價金屬離子（Mg2+orMn2+）
- 一個 降低3'-OH與H的親和力，以利O-進行親核攻擊
- 一個 穩定焦磷酸
②錯配檢查：與小溝作用（無序列特異性）。錯配時不能結合，並讓部分鏈解開，以進入校對區
③外切酶活性位點
- 拇指，手指也與結構的固定有關 O-helix
- 認的是底物位於正確的位點，錯配和rNTP(2'-OH碰撞)都不能很好地位於正確位點
2、dNTP的摻入
1）dNTP被固定在特定位置（被O-helix壓着防止水解）
- 鹼基配對
- PPP與二價金屬陽離子（Mg2+）作用：故金屬螯合劑可以讓聚合酶失活
- O helix和的酪氨酸和鹼基的π-π相互作用
- Lys和Arg和磷酸基團的作用
2）縮合，釋放一個焦磷酸，O helix被釋放
- 羥基攻擊α磷酸
3）DNA移位，新的3‘ 位於活性中心
3、錯配
每105bp會有一個錯配
為何錯配：
- 多為嘌呤-嘌呤，嘧啶-嘧啶間出錯
- 鹼基會異構：keto-enol 和 amino-imino
錯配會減慢合成速度，在這時，聚合酶的外切活性位點會修復
- Proofreading exonuclease 外切酶 3’->5‘活性
- 同一酶的不同活性中心
- 錯配時，將與外切中心親和力高
- 這讓錯誤率降低到 1mistake/107bp
二、Replication Fork 復制叉（原核為例）
1、聚合酶
- 聚合酶I 5'->3' 3'->5'切， 短聚合
- 聚合酶III為核心酶的 全酶 3'->5'切 ， 長聚合
- 其他 修復
2、DNA Primase 引物酶
- 合成RNA引物
- 要和helicase結合以提升活性，故只在復制叉處有活性
Question 引物酶持續合成能力測定？
3、 DNA helicase 解旋酶
結合+ATP-->水解-ADP&Pi-->放開
| |
<-----向前移位--------
- 結合ATP后返回頂部，發夾結合鹼基->隨着ATP水解和釋放->底部
- 原核中 環繞后隨鏈
- 真核中環繞先導鏈
- Helicase是雙向都能走的
assay for helicase
- 本膠應非變性膠
- 如想看到所有DNA 溴乙錠染色
- 為何低鹽助變性：高鹽高電解質強度，掩蓋了DNA雙鏈負電。低鹽，負電互斥
assay for helices polarity
用限制酶切段雙鏈部分
4、SSB：協同結合的方式，結合ssDNA。與骨架靜電作用，與鹼基疏水堆積作用。
5、Topoisomerase 拓撲酶
DNA是10.4bp每一個螺旋的結構
- type1 ：切一個鏈，不用ATP，依靠DNA鏈的能量【環繞數一次±1】
- type2：【一次±2】
- 解索烴
- 在細菌中，gyrase讓鏈unwound以利解旋
- 在嗜熱菌中，anti-gyrase讓鏈overwound，更穩定
assay for topoisomerase
supercoil 泳動速度快
區分 type1 type2:
- kDNA 連環索烴：短膜蟲質粒
看relex的速度 1慢 2快
三、聚合酶的特化 （原核為例）
1、不同的DNA聚合酶
2、滑動夾slide clamp
- 讓聚合酶長距離合成而不掉落
- 完成時，由於聚合酶識別到了盡頭的雙鏈，構象變化，從滑動夾解除
- 然后滑動夾還會參與其他作用蛋白的募集
3、滑動裝載器 裝卸滑動夾
- 過程
- ATP作用下，裝載器張開， 裝載器與滑動夾結合，滑動夾開環
- DNA結合
- ATP水解下， 裝載器與滑動夾解離
- 在有TPJ時， 裝載器裝載滑動夾
- 當滑動夾無用時解離
- 裝載器 與 滑動夾的結合蛋白有相同結合位點，故有作用時不會解離
四、復制叉上的合成（原核為例）
長號模型
1、全酶的組成
- 核心酶 x 3
- τ蛋白
- 柔性接頭
- 滑動加載器
- 滑動夾
2、復制叉蛋白的相互作用
- 聚合酶通過τ亞基與解旋酶相互作用
- 確保聚合、解旋耦聯
- 引物酶與解旋酶相互作用
- 激發引物酶活性，調控岡崎片段長度
HOW THE ENZYMES WORK TOGETHER
1 τ亞基 刺激 解旋酶
2 解旋酶 刺激 引物酶
3 滑動夾 限制聚合酶在DNA上滑動，直到完成
- 后隨鏈解鏈后，與SSB結合。引物酶被激活后，在后隨鏈上合成引物
- 有兩個核心酶參與合成后隨鏈
- 第二個在第一個釋放前已經開始合成，釋放的聚合酶在τ蛋白的限制下，很快又結合上PTJ，開始新合成
3、岡崎片段的切去修補
- RNase H講解RNA引物，但不能降解和dNMP結合的那個rNMP
- 再用外切酶降解
- DNA聚合酶填補空隙
- DNA連接酶連接
trombone model of dna rep P293
五、復制的起始 （原核為例）
1、特定的基因組DNA序列指導DNA復制的起始
2、復制起始的復制子模型
- replicon ： DNA均從稱為復制子的特定位置開始復制 控制復制起始的兩個原件
- replicator：復制器：指導DNA復制起始的整套DNA順式作用序列（其中有復制起始點）
- initiator： 起始子：特異識別復制器中一個DNA元件，並且激活復制的起始
- 依靠ATP的結合與水解調節 核心AAA+ATP基序
六、結合和解旋 起始子蛋白對復制起始位點的選擇和激活（原核為例）
1、蛋白質-蛋白質 與 蛋白質——DNA相互作用 指導起始過程
- 復制機器的組裝
- 起始子蛋白結合DNA的特定序列
- Ecoli 中是 dnaA 結合 9mer ，13mer 是easily unwound序列
- 起始子與復制所需的其他蛋白因子相互作用，蛋白因子和蛋白因子相互作用，組裝成復制機器
- 起始子蛋白結合DNA的特定序列
- dnaA結合富含AT的9mer，使得13mer區解鏈
- 解旋酶在loader的幫助下，結合上dna。因為loader的抑 制，此時解旋酶沒有活性
- 解旋酶募集引物酶，引物酶合成引物。引物導致loader解離，解旋酶擁有活性。
- 解旋酶運動，將鏈上的dnaA除去
- polyIII 全酶的識別解旋酶和引物模板接頭，被引導至特定位點。
- 全酶在PTJ處組裝滑動夾，滑動夾被聚合酶識別，合成。全酶的另外兩個聚合酶位於后隨鏈處
- 解旋酶的作用下，后隨鏈解旋，ssb蛋白包繞
- 解旋酶和全酶τ亞基耦聯行動
- 引物酶合成岡崎片段的引物。
- 引物酶受解旋酶刺激，就是，解旋一段，合成一個引物
- 另外兩個后隨鏈聚合酶合成岡崎片段
七、真核細胞的復制起始與延續
1、真核生物與原核生物酶的比較
2、復制的起始--裝載解旋酶
- 復制器上裝載解旋酶 G1末期
- ORC募集Cdc6、Cdt1 介導的 裝載
- 復制器，起始位點的激活 S 期
- CDK，DDK激活解旋酶
- 兩個過程分開，保證了細胞周期中每個染色體復制一次
- 真核起始子識別復制器，結合ATP
- 進入G1期：
- ORC結合起始點（結合ATP）
- Cdc6 結合上ORC（ATP結合）
- Mcm2-7結合Cdt1
- 這相當於解旋酶裝載器的兩部分分開作用，然后再結合起來
- Cdt1 與 ORC 相互作用，Mcm27——Cdt1 復合體被ORC募集
- Cdc6水解ATP：Mcm2-7頭對頭二聚體裝載
- Mcm2-7包繞雙鏈復制起始點，Cdc6與Cdt1釋放
- ORC水解ATP 重新開始一輪循環
- 同一起始位點可以裝載多個解旋酶
- 進入S期后，CDK、DDK被激活
- DDK作用於已裝載的解旋酶
- CDK作用於Sld2、Sld3
- Sld2、Sld3與Dpb11結合
- 這些蛋白導致解旋酶激活蛋白Cdc45、GINS與解旋酶結合
- 形成CMG復合物
- Cdc45-Mcm2·7-GINS
- Sld2、Sld3解離，Dpb11解離
- Mcm2-7復合體破裂成2，並且各自包繞一條單鏈
- 三種聚合酶按特定順序組裝
- DNA Pol ε 與Cdc45，GINS同時結合在起點（解旋前）
- DNA Pol δ 與 α（引物酶） 要等解旋后才被募集
- 保證酶結合上了，引物才合成
- 只有 CMG 與 三種聚合酶成為復制機器，繼續起作用
- Cdc6 Cdt1 等解離或被破壞
八、每個細胞周期只有一輪復制的發生
真核細胞中有數以百千記的復制起始位點，但是每個細胞周期只能進行一輪細胞復制，否則會導致染色體斷裂等損傷。
1）如果一個潛在復制起始位點在相鄰的復制機器來臨前，並沒有開始復制，那么這個位點就會被失活（復制機器把蛋白去除）；
2）對解旋酶裝載和激活的調控：G1裝載，S激活。
調控：與CDK活性有關
- G1期CDK活性低：允許裝載，不激活
- S G2 M 期 CDK高，激活，抑制裝載
- 在起始點處完成復制后，復制機器離開，會產生一條新鏈，暴露出復制器，這回讓ORC迅速結合，但是CDK水平高，阻止了Cdc6，Cdt1，ORC的相互作用。
九、結束復制
1、子代DNA分子的分離需要拓撲異構酶II
- 環形復制完成如鉸鏈
- 線性性染色體復制完成后有DNA連接成環和蛋白作用，故也有和環形類似的問題
2、后隨鏈的合成不能合成線性染色體的末端（岡崎片段5'端RNA引物切口）
- 細菌的解決方法
- 蛋白質作為末端（通常是酪氨酸提供-OH）
- 真核生物采用端粒來解決：
- 端粒，首尾相接，富含TG的序列（5‘TTAGGG3’）
- 不使用一般聚合酶；使用特殊DNA聚合酶 端粒酶
3、端粒酶
- 組成
- 蛋白亞基
- RNA
- 端粒酶RNA ：TER
- 1.5拷貝的序列（人 5'-TAACCCTAA-3'）
- 特性：
- 反轉錄酶活性
- 不需外源模板
- 不能復制RNA模板以外的序列
- 延伸性，核苷酸前體，延長3‘端與普通聚合酶類似
4、端粒學說
- 端粒酶延伸3’末端解決末端復制問題
- 端粒結合蛋白調節端粒酶活性 和 端粒長度
- 酵母中
- 端粒結合蛋白Rif 1，2是端粒酶弱抑制劑
- 隨着端粒延長，端粒結合蛋白增多，端粒酶活性被抑制
- Cdc 13 是正向激活劑
- 結合端粒ssDNA，募集端粒酶
- 人中
- POT蛋白 抑制作用
- 端粒結合蛋白保護染色體末端
- 斷裂標記 ？？？？？？
- 結合蛋白
- 形成 t 環
- t環的形成使端粒免受DNA修復酶修復
- 但也能阻止端粒酶的作用
- 端粒越短，越難形成t環
- 這產生對端粒長度的控制
- t環的形成使端粒免受DNA修復酶修復
十、染色體的組裝
1、核小體是染色體的結構單位
- 8個組蛋白核心
- 核心DNA
- 1.65圈 147bp
- 連接DNA
- 物種差異 20~60bp
2、組蛋白 帶正電荷的小分子蛋白質
· 帶正電，賴氨酸，精氨酸含量高
連接組蛋白
- H1
核心組蛋白
- H2A H2B
- H3
- H4
每種核心組蛋白都存在一個保守結構域：組蛋白折疊域
組蛋白組裝的順序：
- H3·H4四聚體與 DNA 結合
- 2個 H2A·H2B 二聚體在往上結合
核心組蛋白有 N 端尾巴
3、許多不依賴於DNA序列的接觸介導核心組蛋白與DNA的相互作用
- 與小溝和磷酸骨架的作用
- 主要是蛋白質與小溝附件的磷酸骨架氧原子間形成的氫鍵
- 與鹼基也有小作用
- 這些作用DNA彎曲驅動力
4、組蛋白N端尾巴可穩定盤繞在八聚體上的DNA
- 從DNA螺旋之間或兩側伸出尾巴，作用類似於螺絲上的凹槽，指導DNA左手方式盤旋，形成負超螺旋 。
5、盤繞的DNA呈負超螺旋特性
有利於復制、轉錄
- 真核靠組蛋白： 裝配一個核小體 -1.2linking number
- 原核靠gyrase 促旋酶（需ATP）
- 嗜熱菌有反促旋酶
6、核小體的組裝
- DNA復制后染色體即開始組裝
- 復制叉將核小體分開后，兩個 H3·H4 二聚體隨機去到兩條子鏈上，有助於染色質狀態的遺傳
- Molecluar Biology of Gene 7th 認為H2A/B 將釋放如可溶環境
- 核小體的組裝需要組蛋白伴侶（histone chaperone）
- CAF-1的機制
- PCNA是DNA復制時限制聚合酶位置的滑動器 （那個環）
- PCNA與聚合酶解離后，結合組蛋白伴侶
- 優先將H3·H4復合體結合上DNA
- 繼續組裝步驟 ： 2* H2A/B 招募
高鹽讓核小體崩解
Assay： 定位核小體實驗
微球菌核酸酶MNase ：雙鏈內切酶，非序列特異
連接dna的長度會有物種差異，但是盤繞核小體的長度都是一樣的
Assay： MNase-seq 可以知道位置
1.深度消化 只剩147bp
2.電泳純化
3.兩端深度測序 ？？
4.沿染色體定位
細胞周期任何時機都可以做此實驗
通過核小體的限制，讓復制、轉錄蛋白結合在正確位置
7、染色體的高級結構
- 異染色質和常染色質
- 組蛋白H1與核小體之間的連接DNA結合
- 核小體束能形成更復雜結構 30nm fiber
- 螺線管模型
- 鋸齒模型
-
與連接DNA長度有關
- 進一步凝聚
- 核骨架為中心形成的大環
- 拓撲酶II 保證拓撲學上分離
- SMC 與凝聚、姐妹染色單體聯會有關
- 組蛋白變構體影響核小體功能
- 與修復位點識別有關
- 可能干擾動粒結合
- 活性位點裸露在外