1，Fastq數據質控
2,Fastq轉化成bam，包含頭文件
bwa aln ref.fa test_1.fq > test_1.sai bwa aln ref.fa test_2.fq > test_2.sai bwa sampe ref.fa -r "@RG\tID:<ID>\tLB:<LIBRARY_NAME>\tSM:<SAMPLE_NAME>\tPL:ILLUMINA" test_1.sai test_2.sai test_1.fq test_2.fq > test.sam
3,sam 轉化成bam，如果SAM文件中有header @SQ lines。
samtools view -b -S test.sam > test.bam
##如果沒有header時： samtools faidx ref.fa
## samtools view -bt ref.fa.fai test.sam > test.bam
4,sort bam
samtools sort test.bam > test.sorted.bam
或者：
java -jar picard.jar SortSam I=test.bam O=test.sorted.bam SORT_ORDER=coordinate
5, 標記重復
java -jar picard.jar MarkDuplicate ....
6, index 一下
samtools index test.sorted.repeatmark.bam
7,Base Quality Score Recalibration
....
8, 使用GATK檢測SNP
java -jar GenomeAnalysisTK.jar glm SNP -R ref.fa -T UnifiedGenotyper -I test.sorted.repeatmark.bam -o test.raw.vcf
使用samtools和bcftools檢測SNP
samtools faidx ref.fa
samtools mpileup -d 1000 -DSugf test.sorted.repeatmark.bam > test.raw.vcf ##（samtools mpileup -vf 。。。） bcftools view -Nvcg -d 1000 test.raw.vcf > test.snp.vcf ##(我的軟件運行這步會出錯,用下面兩行代碼代替)
bcftools call -mv test.raw.vcf > test.raw_varient.vcf
bcftools filter -s LowQual -e '%QUAL<20 || DP>100' test.raw_varient.vcf > test.filt_varient.vcf
##也有直接用perl 腳本實現。在使用bcftools 得到variant calling變異后的結果后。需要對結果再次進行過濾，主要依據對比結果中的第8列消息，其中的DP4最為重要，對應的提供了四列：1, 比對結果和正鏈一致的reads數；2, 比對結果和負鏈一致的reads數；3, 比對結果在正鏈的variant 上的reads數；4, 比對結果在負鏈的variant上的reads數。當設定（value3+value4）大於某一閾值，才算是variant。
bcftools檢測生成的vcf格式有10列。1，參考序列名。2，variant所在的left-most位置。3，variant的ID，（默認未設置，用“.”表示）。4，參考序列的allele。5，variant的allele（有多個alleles，則用“，”分隔）。6,variant/reference Quality。7，FILTers applied。8，varient的信息，使用分號隔開。9，Format of the genotype fields， seperated by colon （optional）。10，Sample genotypes and per-sample information（optional）。
bcftools 的第8列中顯示了對variants的信息描述，其中Tag的描述如下：
Tad Format Description
AF1 double Max-likelihood estimate of the site allele Frequency （AF）of the first ALT allele
DP int Raw read depth (without quality filtering)
DP4 int[4] high-quality reference forward base, ref reverse, alternate for and alt rev bases
FQ int consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwise
MQ int Root-Mean-Square mapping quality of covering reads PC2 int[2] Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2 PCHI2 double Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samples PV4 double[4] P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias QCHI2 int Phred-scaled PCHI2 RP int # permutations yielding a smaller PCHI2 CLR int Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraint UGT string Most probable genotype configuration without the trio constraint CGT string Most probable configuration with the trio constraint
使用bcftools過濾掉不可靠的位點：
bcftools filter的參數：
-e -exclude 主要用於表達式方式去除匹配上的位點，這個參數很關鍵，過濾需要此表達式
-g -SnpGap 過濾INDEL附近的snp位點，比如-SnpGap 5 則過濾INDEL附近5個鹼基距離內的SNP
-G -IndelGap 過濾INDEL附近的INDEL位點
-o -output 輸出文件的名稱
-O -output-type 輸出的格式，一般z和v都行
-s -soft-filter 將過濾掉的位點用字符串注釋
-S -set-GTs setgenotypes of failed samples to missing value (.) or reference allele (0) （將不符合要求的個體基因改為"."）
eg:過濾QUAL小於10，DP值小於5，INDEL附近的位點
bcftools filter -O v -o test.filter_variant.vcf -s LOWQUAL -e 'QUAL<10 || FMT/DP < 5' --SnpGap 5 --set-GTs . test.vcf.gz
提取過濾后的SNP位點
bcftools view -v snps test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf
或者在vcf文件中的INFO列里，如果是INDEL的話，會標注出INDEL，因此提取SNP也可以：
grep -v 'INDEL' test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf
注意：
|| 與 | 區別：都表示“或”運算， 但是 || 運算符第一個表達式成立的話，后面的表達式不運算，直接返回。而 | 對所有表達式都判斷。 && 與 & 的區別同理
參考：https://www.cnblogs.com/xiaofeiIDO/p/6857745.html
http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/248