annovar軟件組件介紹之一——table_annovar.pl（譯）
對於初學者，使用ANNOVAr的最簡單方法是使用table_annovar.pl程序，該程序采用輸入突變文件（例如，VCF文件）並生成帶有多個制表符分隔的輸出文件，每個列表示一組注釋。另外，如果輸入是VCF文件，則程序還生成新的VCF輸出文件，其中INFO字段填充有注釋信息。
假設我們已經下載了ANNOVAR包並使用tar zxvf annovar.latest.tar.gz解壓縮包。您將看到bin/目錄包含有多個.pl后綴的Perl程序。（注意，如果您已將ANNOVAR路徑添加到系統可執行文件路徑中，則鍵入annotate_variation.pl即可，而不是鍵入perl annotate_variation.pl。首先，我們需要使用annotate_variation.pl下載相應的數據庫文件，然后我們將運行table_annovar.pl程序來注釋example/ex1.avinput文件中的突變。
[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar refGene humandb/
[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb cytoBand humandb/
[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar exac03 humandb/
[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar avsnp147 humandb/
[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar dbnsfp30a humandb/
[yhwang@biocluster ~/]$ table_annovar.pl example/ex1.avinput humandb/ -buildver hg19 -out myanno -remove -protocol refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a -operation gx,r,f,f,f -nastring . -csvout -polish -xref example/gene_fullxref.txt
輸入文件包含多個列，前幾列是您的輸入列，以下每個列對應於用戶在命令行中指定的“協議”之一。Func.refGene, Gene.refGene, GeneDetail.refGene, ExonicFunc.refGene, AAChange.refGene列包含關於突變如何影響基因結構的各種注釋。Xref.refGene列包含基因的交叉引用；在這種情況下，已知的遺傳疾病是否是由該基因的缺陷引起的（該信息在命令行的示例/gene_fullxref.txt文件中被填充）。對於接下來的幾列，ExAC *列表示所有樣本中的等位基因頻率以及Exome Aggregation Consortium數據集中的子群體，而avsnp147表示dbSNP 147版本中的SNP標識符。其它列包含預測非同義突變使用幾種廣泛工具的得分，PolyPhen2 HDIV得分、PolyPhen2 HVAR得分，LRT得分，MutationTaster得分，MutationAssessor得分，FATHMM得分，GERP ++得分，CADD得分，DANN得分，PhyloP得分和SiPhy得分等等。
我們可以更加詳細地檢查命令行。-operation參數指定ANNOVAR每個協議使用哪些操作：g表示基於基因，gx表示基於基因的交叉引用注釋（來自-xref參數），r表示基於區域，f表示基於過濾器。如果您不提供外部參考文件，則操作只能是g。您將在其他網頁中找到有關基因/區域/基於過濾器的注釋的詳細信息。有時，用戶需要制表符分隔文件而不是逗號分隔文件，刪除上述命令的-csvout參數就可以完成。
在上面的命令中，我們使用-xreffile參數為基因組提供注釋。如果文件包含標題行，則可以為基因提供多個注釋（而不僅僅是一個列）。為了說名這一點，我們可以檢查example/gene_fullxref.txt文件的前兩行（包括標題行）。
[yhwang@biocluster ~/project/annotate_variation]$ head -n 2 example/gene_fullxref.txt
#Gene_name pLi pRec pNull Gene_full_name Function_description Disease_description Tissue_specificity(Uniprot) Expression(egenetics) Expression(GNF/Atlas) P(HI) P(rec) RVIS RVIS_percentile GDI GDI-Phred
A1BG 9.0649236354772e-05 0.786086131023045 0.2138232197406 alpha-1-B glycoprotein . . TISSUE SPECIFICITY: Plasma.; unclassifiable (Anatomical System);amygdala;prostate;lung;islets of Langerhans;liver;spleen;germinal center;brain;thymus; fetal liver;liver;fetal lung;trigeminal ganglion; 0.07384 0.31615 -0.466531444 23.51380042 79.3774 1.88274
標題行以#開頭。然后，交叉引用文件包含15種基因注釋。您可以運行上面的相同命令，結果文件可以從此處下載。下面顯示了部分文件，為用戶提供了一個示例：
table_annovar.pl可以直接支持VCF文件的輸入和輸出（注釋將被寫入輸出VCF文件的INFO字段）。我們試試這個：
[yhwang@biocluster ~/]$ table_annovar.pl example/ex2.vcf humandb/ -buildver hg19 -out myanno -remove -protocol refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a -operation g,r,f,f,f -nastring . -vcfinput
您可以在此處下載輸出文件：ex2.hg19_multianno.vcf。此外，制表符分隔的輸出文件也可以（例如， ex2.hg19_multianno.txt），其中包含不同格式的類似信息。您可以在文本編輯器中打開新的VCF文件，並檢查文件中已更改的內容：VCF文件中的INFO字段現在包含您需要的注釋，以字符串ANNOVAR_DATE開始，ALLELE_END結束。如果多個等位基因位於同一個基因座中，您將在INFO字段中看到多個此類符號。屏幕截圖如下所示：
annotate_variation.pl
annotate_variation.pl程序是ANNOVAR中的核心程序。 我們可以轉到ANNOVAR目錄，然后逐個運行以下三個命令。
annotate_variation.pl -geneanno -dbtyep refGene -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/
annotate_variation.pl -regionanno -dbtype cytoBand -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/
annotate_variation.pl -filter -dbtype exac03 -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/
這三個命令分別對應於基於基因、基於區域和基於過濾器的注釋。
第一個命令注釋ex1.avinput文件中的12種突變，並將它們分類為intergenic、intronic、non-synonymous SNP、feameshift delete、large-scale duplication等。
檢查ex1.avinput文件以查看簡單文本格式，每一行對應一個突變。花費幾秒鍾完成注釋，生成兩個輸出文件為ex1.avinput.variant_function和ex1.avinput.exonic_variant_function。檢查example/目錄中的兩個輸出文件以查看它們包含的內容：在variant_function文件中，第一列和第二列注釋突變對基因結構和受影響的基因，但其他列則從輸入文件中重現。在exonic_variant_function文件中，第一，第二和第三列注釋輸入文件中的突變行號，突變對編碼序列的影響和基因/轉錄本受到影響，但其他列從輸入文件中復制。
接下來，該程序在ex1.avinput文件中注釋突變，並為這些突變識別細胞遺傳學帶。注釋過程應該小幾秒鍾。檢查輸出文件ex1.avinput.hg19_cytoBand以查看它包含的內容。第一列顯示cytoBand，第二列顯示注釋結果，其他列從輸入文件中再現。
接下來，程序識別ex1.avinput中exac03數據庫中未觀察到的突變子集（保存在ex1.avinput.hg19_exac03_filtered中）以及用等位基因頻率觀察到的突變子集（保存在ex1.avinput.hg19_exac03_dropped文件中）。
上述命令代表了一組關於ANNOVAR如何幫助研究人員宣傳高通量測序數據產生的遺傳變異的基本實例。