之前不是很理解這兩個概念，看了本文之后就差不多理解了。
我們都知道RNA-seq是通過NGS技術來檢測基因表達量的測序方法。在衡量基因表達量方面，若是單純以比對到參考基因的Reads個數（我們通常稱之為Count值）來衡量基因的表達量，在統計上是一件相當不合理的事。今天就為大家介紹一下衡量基因表達量的RPKM和FPKM兩種方法。
在隨機抽樣的情況下，序列較長的基因被抽到的概率本來就會比序列短的基因高，如此一來，序列長的基因永遠會被認為表達量較高，而錯估基因真正的表達量。在測序深度不同的情況下，測序深度更深的樣品中，比對到每個基因的Read數量更多。
為排除因基因的長度、測序深度等因素造成的干擾，RPKM（Reads Per Kilobase Million）和FPKM（Fragments Per Kilobase Million）等方法就應運而生了。
RPKM
RPKM是將Map到基因的Reads數除以Map到Genome的所有Read數(以Million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)。
FPKMFPKM是將Map到基因的Fragments數除以Map到Genome的所有Read數(以Million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)。
從公式上可以看出，方法是將Reads（Fragments）Count進行標准化，分別是對測序深度標准化（以Million為單位）和對基因長度標准化（以KB為單位），從而消除了因測序深度和基因長度不同對基因表達量的影響。
RPKM與FPKM的區別
FPKM計算的是片段(Fragments)，而RPKM計算的是數據(Reads)。Fragment比Read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是Pair-end的一個Fragment，也可以是一個Read。RPKM的誕生是針對SE測序，FPKM則是在PE測序上對RPKM的校正。
F是fragments，R是reads，如果是pair-end測序，每個fragments會有兩個reads，FPKM只計算兩個reads能比對到同一個轉錄本的fragments數量，而RPKM計算的是可以比對到轉錄本的reads數量（即不管是不是兩個reads是不是能比到同一個轉錄本上）。如果是single-end測序，二者FPKM和RPKM是一致的。
TPM可以用於同一物種不同組織間的比較，因為Sum(TMPs)的值總是唯一的。
然而如果要在不同物種之間比較，則需要利用物種間的同源基因，取top 1000 rank 最保守的同源基因，取median expression levels，來計算scaling factor.