R基因的表觀調控控制水稻稻瘟病抗性與水稻產量平衡
名詞解析
1.
寫在前面
上海植生所何祖華老師實驗室最新(2月2日)發表在Science上的這篇文章短小精悍地講了水稻一個locus上的兩個基因通過蛋白水平的競爭協同控制水稻稻瘟病抗性和水稻產量平衡的故事。
一、摘要
在作物育種中，抗病和糧食產量的平衡至關重要。現實情況是單一的抗病基因（通常為R基因）很容易被病菌攻克，且過多引入R基因很可能影響糧食產量。在這篇文章中，研究者發現水稻Pigm locus包含一串多個nucleotide-binding leucine-rich repeat （NB-LRR）基因。它們的存在使水稻具備對稻瘟病菌的抗性同時不會影響水稻產量。在這一串NB-LRR中，PigmR基因呈現對稻瘟病菌的廣譜抗性，而PigmS競爭性的抑制PigmR同源二聚體的形成進而抑制抗性。PigmS的表達受到表觀調控。其作用於增加種子產量，進而平衡由於PigmR抗病性作用導致的水稻產量損失。因此，這篇文章揭示了通過表觀控制存在拮抗作用的NB-LRR基因來平衡抗病和產量的機制，這也為培育更優質的作物品種提供了一個新的思路。
二、正文
水稻稻瘟病（rice blast）是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）這種真菌引起的。稻瘟病是最嚴重的水稻病害之一。中國本土的水稻品種Gumei 4（GM4）攜帶抗稻瘟病的locus，在稻瘟病育種界被當作供體而被廣泛利用。GM4來源的水稻品種或者攜帶Pigm抗性locus的近等基因系（NIL-Pigm）呈現持續的稻瘟病抗性且對其他病菌的抗性沒有影響（如下圖A和B）。然而，Pigm locus抗病作用的分子機制未知。
1、定位抗病基因
之前的研究中，研究者已經將Pigm locus定位在了一個BAC上的一段序列。測序發現此段序列包括13個NB-LRR基因，其中有三個可以被完整轉錄（R4，R6，R8），10個為假基因，還有一個為Ty3/gypsy反轉座子。GM4品種的Pigm locus與野生稻相同的區域具有相似性，這暗示了Pigm locus很可能是從一個野生稻馴化來的。
接着，為了進一步證明Pigm locus是GM4品種具備稻瘟病抗病性的locus，研究者將GM4品種利用伽馬射線進行誘變，找出了三個GM4抗病性狀抑制突變體（suppressor mutant）。結果發現這三個突變體每個都攜帶Pigm locus一段序列的缺失。
2、PigmR基因介導的稻瘟病抗性
利用不具備稻瘟病抗病性狀的水稻品種（NIPB），研究者用R6（PigmR）等Pigm locus基因做互補實驗。結果發現只有PigmR基因可以使NIPB水稻品種獲得稻瘟病抗病性狀。PigmR轉基因植株抗病的效果與GM4相同，具備對50個病菌isolates的抗性。為了進一步證明PigmR基因就是Pigm locus具備抗性的基因，研究者利用RNAi沉默Pigm近等基因系中的PigmR基因，發現抗性減弱。
R4基因不具備稻瘟病抗性，它與PigmR只在LRR結構域存在4個氨基酸的差別。實驗證明這4個氨基酸對PigmR介導的抗病性均具有重要作用，再加上之前提到的PigmR轉基因植株對50個病菌isolates具備抗性的證據，這些暗示了PigmR的LRR結構域通過識別某些保守的稻瘟病菌effector而作用。
3、PigmS基因抑制PigmR基因介導的稻瘟病抗性
有些意外的是，研究者發現Pigm近等基因系或PigmR轉基因植株中R8（PigmS）的異位表達（35S promoter::PigmS或PigmR promoter::PigmS）會促進稻瘟病菌侵染，也就是PigmS抑制PigmR介導的抗病反應。PigmS轉基因植株中的PigmR表達量不變，暗示PigmR和PigmS的相互作用存在於蛋白水平。首先，酵母雙雜交實驗顯示PigmR和PigmS各自的同源二聚體形成是通過CC結構域而不是LRR結構域。PigmS和PigmR在體內可以形成異源二聚體（下圖C）。然后，PigmS-PigmR異源二聚體與PigmR-PigmR同源二聚體的蛋白競爭實驗（下圖F）暗示PigmS-PigmR異源二聚體化通過抑制PigmR同源二倍體的形成抑制稻瘟病抗性。下一步，研究者從植物生理反應角度驗證了PigmS通過干擾PigmR同源二聚體的形成抑制稻瘟病抗性（下圖G）。利用煙草，研究者發現PigmS會抑制PigmR介導的細胞死亡（cell death），進一步發現PigmS的CC結構域的三個氨基酸對於PigmR介導的細胞死亡起着決定作用。
4、PigmS基因的表達量受到的表觀調控
PigmR在水稻所有的組織中表達水平都很低，而PigmS在花粉/花絮中高表達，在其他組織中表達量很低（下圖A）。PigmS啟動子包括兩個串聯小轉座子（miniature transposon）—MITE1和MITE2。利用PigmS promoter::GUS實驗發現MITE1和MITE2的存在會降低PigmS在葉片中的表達（下圖B）。利用重亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencing）發現Pigm近等基因系的葉片中PigmS啟動子區域存在很高的甲基化水平（下圖C）。花粉中PigmS啟動子的CHH甲基化水平比葉片中的低很多，這暗示了CHH甲基化水平的差異也許導致了PigmS在花粉和葉片中表達水平的不同。同時，小RNA測序（small RNA sequencing）和northern blot顯示24-nt siRNA在MITE1和MITE2區域積累。將RNA dependent DNA methylation（RdDM）通路基因進行RNAi，研究者發現PigmS的表達水平顯著提高（下圖D）。將PigmS啟動子中的MITE1和MITE2敲掉，發現PigmS在葉片中的表達量升高，同時抑制了PigmR介導的稻瘟病抗性。這些都支持了PigmS受RdDM介導的基因沉默的調控。
5、PigmS作用於平衡水稻產量
研究者發現PigmR轉基因植株的水稻產量降低，這主要體現在粒重的降低。Pigm近等基因系的粒重降低，但是產量沒有影響，主要是因為種子量增加。PigmS轉基因植株產量增加，主要是因為種子量增加。因此，PigmR和PigmS兩個基因的轉基因植物呈現與非轉基因植物相同的產量。與親本相比，Pigm近等基因系在2012-2014年稻瘟病菌侵染的田間試驗中產量明顯提高。
綜合所有的研究結果，研究者提出Pigm locus在稻瘟病抗病反應中的作用機制--表觀調控控制PigmS基因的表達量，通過PigmS-PigmR蛋白異源二聚體與PigmR蛋白同源二聚體的動態變化從而控制抗病反應和產量之間的平衡。正是這種表觀調控的作用力，使一個基因簇進化出兩種作用不同的NB-LRR基因。這種表觀調控作用也減少了進化過程中PigmR識別菌種的突變，使PigmR具有廣譜抗性。
研究者已經利用Pigm locus育出了一個優質水稻品種—Longliangyou3189，它在多個種植地呈現抗稻瘟病，同時高產的特性。
三、文章總結
這是一篇實驗設計周全，邏輯清晰的文章。為了說明一個結論，研究者從不同角度設計實驗進行驗證且陰性對照完備。從參考文獻中看到Pigm locus的圖位克隆2006年已完成，研究者花費10年時間完成了功能實驗及性狀驗證，得到Pigm locus的作用機制。足可以反映一項優質的研究需要足夠的耐心和信念。