單分子測序reads（PB）的混合糾錯和denovo組裝
我們廣泛使用的PBcR的原始文章就是這一篇
原文鏈接：Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads
簡介：PBcR里面有一種自糾算法（PacBioToCA），糾錯的核心本質就是多重序列比對，為了加快比對速度使用了MHAP算法（MinHash）。三代的錯誤分布不是完全隨機的，不要以為錯誤是均勻分布的！！！
摘要：
PB技術可以產生極 長的reads，可以顯著提高基因組和轉錄組的組裝。
然而，單分子測序的reads的error rate非常高，這限制了它們在重測序方面的應用。
為了解決這個問題，我們創造了PBcR這個糾錯算法和組裝策略：使用短的、高精准度的reads 來校正單分子測序reads中的錯誤。
我們在PB RS平台證明了這個算法的實用性，從噬菌體、原核、真核；從基因組到轉錄組。
我們的長reads糾錯達到了99.9%的base-call accuracy，從而使得組裝的效果比當下的策略更好。
在最好的栗子里，三代的組裝結果的contig的N50是二代的組裝結果的五倍。
前言：
二代技術：454焦磷酸測序，Illumina邊合成邊測序，低成本，高通量；相較於一代的sanger測序。
二代的明顯的缺點：測序之前，源DNA需要擴增，會引入偏差；reads短，導致組裝和分析困難。
三代，單分子，實時測序，無偏差，reads長，周期短，有利於denovo的基因組和轉錄組組裝，可以解決復雜的重復，可以跨越基因的整個轉錄本。
然而，三代只有82.1%~84.6%的准確率，主要由insertion和deletion造成(Supplementary Fig. 1).
如此高的錯誤率會嚴重影響reads的比對，雙序列比對會double錯誤率，遠超過5%~10%的組裝軟件的承受范圍；簡單的增加alignment sensitivity是不可行的。(Supplementary Table 1 and Supplementary Figs. 2 and 3).
此外，PacBio技術使用了發卡接頭hairpin adaptors 來對雙鏈double-stranded DNA進行測序，這將會導致嵌合體chimeric reads ，如果測序反應進行到DNA的兩條鏈，
雖然你在PacBio RS上可以通過多次讀取一個環狀分子（circular consensus or CCS） 來生成高准確度的reads，這種方法降低了reads的長度，受分子被遍歷的次數影響，導致了一個更短的reads，因此長的single-pass reads有一個很大的潛在的優勢，如果可以從算法層次上管理錯誤率。
為了克服單分子測序數據的限制，解鎖它在denovo組裝上的全面的潛能，我們開發出了一套方法來利用短的、高精確度的序列來糾正 長的、單分子的內在錯誤(Fig. 1).
PBcR單分子reads糾正和組裝方法：
a）黑線表示錯誤，粉紅色條表示single-pass PacBio RS reads，這很難檢測reads之間是否有overlap；
b）將高保真短讀長reads比對到容易出錯的長reads，之所以可以計算出准確的比對結果，是因為短長是長長錯誤的一半。短reads上的黑線表示比對錯誤，是短reads和長reads之間共同的錯誤。此外，兩個不精確的重復導致短reads的堆積，為了避免reads比對的錯誤，算法選擇了一個cutoff,C 前C的留下，后C的丟掉。（PB上高錯誤的區域Hiseq也是比對不上的）
c）留下來的比對用來生成一個新的consensus 序列（紫色），trimming and splitting長reads，如果有短reads有gap（在沒有覆蓋度的地方任務截斷了，絕對有假陽性，因為二代測不到GC特殊區域）。測序錯誤會傳播給PBcR，當PB和Hiseq有共同的錯誤。
d）糾錯后，可以很容易的檢測出long PBcR sequences的overlap。
e）組裝結果可以跨過重復，那些短reads無法跨過的地方。
注：PB中的無效區域是肯定存在的，可以直接通過Hiseq的覆蓋度信息去除（不要切斷中間），可能還要考慮GC區域才會完美。
嵌合體怎么解決，還是在組裝時會自動解決。
我們的PBcR（PacBio corrected Reads）算法作為Celera Assembler的一部分，截斷和糾正單獨的單分子reads，通過首先將短reads 比對到長reads上來計算一個高度准確 混合consensus 序列：提高了reads的准確度從80%到了99.9%。
然后，糾正了的混合PBcR reads可以來單獨進行denovo組裝，或者結合其他數據，或者導出來做其他應用。
下面將會展示幾個重要的基因組，包括之前沒有測序的1.2-Gbp。incorporation of PacBio data using this method leads to greatly improved assembly quality versus either first- or second-generation sequencing, indicating the promise of ‘third-generation’ sequencing and assembly.
結果
長reads的denovo組裝
糾錯准確度和結果
混合denovo組裝
長read的覆蓋度對組裝的影響
鸚鵡基因組的組裝結果
單分子RNA-Seq糾錯
討論
方法
待續~